胡美忠， 鄔小蘭， 郁建生

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁 554300）

畜牧業(yè)中抗生素的濫用嚴(yán)重威脅到食品安全和人類健康，帶來了藥物殘留、耐藥致病菌、環(huán)境污染等弊端。鑒于抗生素濫用的危害，已有多個國家在養(yǎng)殖業(yè)中限制甚至禁止使用抗生素，如1992年瑞士立法禁止使用飼用抗生素，歐盟于1999年立法禁止使用抗生素作為促生長劑，我國近幾年針對抗生素在畜牧業(yè)中濫用問題，提出禁止或者逐步禁止飼用抗生素的使用，并提出鼓勵和支持抗菌肽、微生物制劑、中藥提取物等新獸藥研發(fā)。

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）是一類產(chǎn)芽孢，好氧或兼性好氧的革蘭陽性桿狀細(xì)菌，是我國農(nóng)業(yè)部允許直接喂養(yǎng)動物的菌種?？莶菅挎邨U菌分布廣泛，抗逆性強(qiáng)，一些菌株能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等消化酶、合成多種生理活性物質(zhì)、產(chǎn)生抗菌脂肽、在腸道中奪氧能力強(qiáng)（鄒艷，2017；馬樹瑞等，2016）。 這些優(yōu)良特性在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中有利于提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動物生長發(fā)育和提高免疫力，且具無毒副作用、無殘留、原生態(tài)等特性?？莶菅挎邨U菌及其代謝產(chǎn)物，是理想的抗生素替代物之一 （王宗偉等，2015；鐘蔚，2013），本研究旨在篩選尋找優(yōu)良的枯草芽孢桿菌，以期將來應(yīng)用于動物生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品、培養(yǎng)基及指示菌 樣品來源：貴州銅仁、貴州赤水、貴州遵義等地土壤、枯葉、動物糞便。

Landy培養(yǎng)基：酵母粉 1 g，L-苯丙氨酸0.002 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，5水硫酸銅 0.0016 g，7水硫酸鎂 0.5 g，7水硫酸亞鐵0.0015 g，L-谷氨酸 0.5 g， 硫酸錳 0.005 g， 氯化鉀 0.5 g，水 1 L，pH 7。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1 L，pH 7.2。

纖維素酶檢測培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，水1 L。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g（洗凈去皮，稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用八層紗布過濾取濾液），葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，水 1 L，自然pH（不加瓊脂則為PD培養(yǎng)基）。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水 1 L，自然pH。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸銨 2 g，硫酸鎂 0.1 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水 1 L，pH 6.2±0.2。

指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923），大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC 25922），黑曲霉（Aspergillus niger），產(chǎn)朊假單絲酵母（Candida utilis），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為本實驗室（民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心中獸藥微生物發(fā)酵技術(shù)研究室）分離純化鑒定保藏。

1.1.2 主要儀器 垂直流超凈工作臺 （ZHJHC1214C），上海智城；pH 計（DELTA 320），上海閔勝；臺式高速冷凍離心機(jī)（EXPERT 16K-R），湖南吉爾森；恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9042），上海一恒；全自動高壓滅菌鍋（HVE-50），華粵；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（DHP260），金壇市國旺試驗儀器廠；安捷倫1100型液相色譜儀；安捷倫G6400三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 選取農(nóng)田、菜園等熟地，取距離泥土表面5～20 cm土壤，或采集枯葉、新鮮動物糞便，裝置于無菌采樣袋中，置于4℃下保藏待用。

1.2.2 菌種分離純化 無菌條件下取采集的樣品，置于滅菌的離心管，加入適量無菌蒸餾水，混勻，置于85～90℃水浴鍋中水浴20 min（或水浴煮沸10 min），冷卻，吸取50μL樣品液涂布于LB固體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24 h，挑取大小、形態(tài)不一致的菌落分別繼續(xù)劃線培養(yǎng)2次，得純培養(yǎng)菌落，采用25%甘油 -70℃保藏待用。

1.2.3 產(chǎn)抗菌脂肽芽孢桿菌篩選 保藏的菌株，使用適量LB液體培養(yǎng)基活化，活化的菌株劃線培養(yǎng)于LB固態(tài)培養(yǎng)基，待長出菌落后，挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)15 h作為種子液，種子液按1%比例接種于Landy培養(yǎng)基，37℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，8000 g離心去除菌體，以金黃色葡萄球菌及大腸桿菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測試上清液抑菌活性（制備指示菌平板，無菌打孔器打孔后，孔加入80μL上清液，37°C培養(yǎng)18～24 h后測量抑菌圈大?。?/p>

1.2.4 產(chǎn)抗菌脂肽芽孢桿菌分子生物學(xué)鑒定 前期篩選得到數(shù)株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制效果的菌株，選擇抑菌效果最好的菌株，編號為S21，菌株S21總DNA提取，16SrDNA擴(kuò)增和測序由蘇州泓迅生物科技有限公司完成，測序所得的16SrDNA序列校對后，與NCBI的Gen-Bank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）數(shù)據(jù)庫和http://www.ezbiocloud.net數(shù)據(jù)庫分析，根據(jù)序列同源性，確定菌株的種屬關(guān)系。

1.2.5 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)酶特性

1.2.5.1 蛋白酶 菌株S21使用LB培養(yǎng)基活化，點接種于添加了10%脫脂奶粉的LB培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)60 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)蛋白水解圈。

1.2.5.2 脂肪酶 菌株S21活化，點接種于添加了1%三丁酸甘油酯的LB培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)72 h后觀察菌落周圍是否出現(xiàn)脂肪水解圈。

1.2.5.3 纖維素酶 菌株S21活化，點接種于纖維素酶檢測培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)48 h后，往平板表面傾入0.1%的剛果紅溶液（蓋住菌落即可），靜置30 min，倒出0.1%的剛果紅溶液，再往平板傾入5%氯化鈉溶液，輕輕搖晃10 min，倒出5%氯化鈉溶液，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明水解圈。

1.2.5.4 淀粉酶 菌株S21活化，點接種于添加了1%淀粉的LB培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)48 h后，往平板倒入碘液，觀察菌落周圍是否非藍(lán)色圈。

1.2.6 枯草芽孢桿菌21產(chǎn)抗菌脂肽分離純化及鑒定 菌株S21活化，接種于LB培養(yǎng)基作為種子液，種子液按1%比例接種于Landy培養(yǎng)基，37℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，8000 g離心去除菌體得上清液，上清液鹽酸調(diào)節(jié)pH至2后，4℃靜置過夜，7000 r/min離心得沉淀，沉淀用適量甲醇抽提（調(diào)節(jié)pH至7），蒸干得殘留物，殘留物加入適量蒸餾水溶解，得粗脂肽提取物。粗脂肽提取物使用半制備液相色譜進(jìn)行純化，流動相：乙腈（含0.1%三氟乙酸），水（含0.1%三氟乙酸），色譜柱：agilent XDB-C18，波長：214 nm，流速：0.8 mL/min，時間：0～35 min，90%乙腈—90%乙腈。利用安捷倫G6400三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀分析半制備色譜純化得到的活性抑菌峰。

1.2.7 抗菌脂肽性質(zhì)研究

1.2.7.1 抑菌譜 根據(jù)1.2.5方法制備得粗脂肽提取物，采用瓊脂擴(kuò)散法測試其對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，植物乳桿菌，產(chǎn)朊假單絲酵母，黑曲霉抑制活性（Jagadeeswari等，2010）。具體步驟為：指示菌使用LB培養(yǎng)基 （乳酸菌MRS培養(yǎng)基，霉菌PD培養(yǎng)基，酵母YPD培養(yǎng)基）活化，制備出約107cfu/mL指示菌菌液，相應(yīng)指示菌固體培養(yǎng)基融化待其溫度降至40℃左右后，按1%比例加入指示菌菌液，混勻倒平板，待平板凝固，打孔器打孔，孔中加入70μL粗抗菌脂肽，37℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.7.2 穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性，根據(jù)1.2.5方法制備得粗脂肽提取物，分別60℃（水浴）、80℃（水?。?、100 ℃（煮沸）、121 ℃（滅菌鍋） 處理 20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測試處理后的抗菌脂肽殘留抗菌活性。

酸堿穩(wěn)定性，根據(jù)1.2.5方法制備得粗脂肽提取物，取粗脂肽提取物，采用HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)其 pH 為 2、3、4、5、6、7、8、9、10， 以相應(yīng) pH相同的蒸餾水為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測試不同pH下抗菌脂肽的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抗菌脂肽芽孢桿菌篩選 利用芽孢桿菌可產(chǎn)生耐高溫芽孢的特性，水浴加熱采集的樣品除去非芽孢類細(xì)菌，從銅仁、遵義等地的土壤、枯葉、動物糞便中共篩選到芽孢桿菌200余株，通過是否產(chǎn)抗菌物質(zhì)篩選，從200余株芽孢桿菌中篩選得到產(chǎn)抗菌物質(zhì)的芽孢桿菌4株，編號分別為 B1、Y4、S21、20。 其中 S21 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制效果，其他三株根據(jù)篩選的操作方法，其發(fā)酵上清液僅僅對金黃色葡萄球菌有抑制效果。故選定編號S21的菌株為進(jìn)一步研究菌株。

2.2 菌株S21分子生物學(xué)鑒定 原核生物的16SrDNA基因含有高度保守序列、中度保守和高度變異序列，可以很好區(qū)分種屬關(guān)系，且序列長度1500 bp左右，測序方便。故16SrDNA鑒定是目前被最常用來作為細(xì)菌鑒定的方法 （楊霞等，2008；劉文強(qiáng)等，2007；焦振泉等，2001）。蘇州泓迅生物科技有限公司對菌株S21總DNA提取，16SrDNA 擴(kuò)增和測序，使用 seqman（7.1.0）軟件分析，得到1428 bp堿基，在www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站中使用BLAST在基因庫中進(jìn)行同源性搜索，所得結(jié)果中表明菌株S21與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168（complete genome） （accession number:AL009126.3），Bacillus subtilis strain NCIB 3610 （complete genome）（accession number:CP020102.1） 等 Bacillus subtilis相似度達(dá)99%，http://www.ezbiocloud.net進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)與 Bacillus subtilis subsp.Subtilis（NCIB 3610（T））相似度為 99.79%，結(jié)合比較結(jié)果，鑒定菌株S21為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)酶特性 枯草芽孢桿菌在代謝過程中能產(chǎn)生多種酶 （劉斯斯等，2017；劉秀俠等，2017；周平等，2016）。 對枯草芽孢桿菌S21的產(chǎn)酶特性定性檢測見圖1。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶定性檢測試驗中，枯草芽孢桿菌S21菌落周圍均出現(xiàn)水解圈，說明其產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶和淀粉酶。

圖1 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)酶特性

2.4 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽分離純化及鑒定 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽分離純化及鑒定見圖2。粗抗菌脂肽經(jīng)過半制備色譜純化和抑菌試驗檢測，發(fā)現(xiàn)保留時間為15.163 s的峰為活性峰，此活性峰經(jīng)過ESI-TOF_MS質(zhì)譜鑒定，可得 到 ＜M+H ＞=1008，＜M-CH2+H ＞=1022，＜M-CH2++H＞=1036 三個加氫離子峰，＜M+Na＞=1030，＜M-CH2++Na＞=1044加鈉離子峰，他們之間的分子量相差 14（即 CH2-），結(jié)合文獻(xiàn)資料（李寶慶等，2010；Xiaohong，2008；陳華等，2008），可以推斷出此抗菌脂肽為surfactin族系列物，具體屬于surfactin A系列、surfactin B系列還是surfactin C系列有待進(jìn)一步分析。

圖2 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽分離鑒定圖

2.5 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽性質(zhì)研究枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽的抑菌性、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性見表1。從表1可知，枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，植物乳桿菌，黑曲霉表現(xiàn)出不同強(qiáng)弱的抑菌活性，但是對產(chǎn)朊假單絲酵母無抑制活性?？莶菅挎邨U菌S21產(chǎn)抗菌脂肽能承受一定的溫度，在80°C及以下溫度處理，其活性損失不大，但是對高溫抵抗力比較弱，100°C其活性可損失約達(dá)40%。酸堿方面，枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽在堿性環(huán)境下其抑菌活性不受影響，在酸性環(huán)境下，其抑菌活性受到一定抑制，但仍然能保留較大活性，總體來說，枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較好。

3 討論

Surfactin是芽孢桿菌屬部分菌株代謝產(chǎn)生的一種由七個氨基酸和13～15個碳原子的β羥基脂肪酸鏈組成的環(huán)狀抗菌脂肽（莊國宏，2014），研究表明surfactin具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗支原體和原蟲等活性 （翟少偉等，2015；任鵬舉等，2014），在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境治理等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，特別是在畜牧業(yè)中替代抗生素，具有非常好的潛力。

動物飼料中添加各種酶有利于動物生產(chǎn)，因為酶可以幫助消化飼料，提升飼料報酬，故酶制劑在動物生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛 （高研等，2017；高研等，2016a； 高研等，2016b；孫玉明等，2016），利用飼用益生菌本身產(chǎn)酶特性，制備微生態(tài)制劑，在動物消化也可起到重要作用。

本研究篩選到一株能產(chǎn)對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制效果抗菌脂肽的芽孢桿菌，經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定為枯草芽孢桿菌，進(jìn)一步研究表明枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)surfactin，且產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶，其產(chǎn)生的抗菌脂肽抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較好，說明枯草芽孢桿菌S21是一株性能優(yōu)良的菌株，能夠用于動物養(yǎng)殖，比如作為微生態(tài)制劑、發(fā)酵飼料和飼用抗菌脂肽生產(chǎn)菌種。

表1 枯草芽孢桿菌S21產(chǎn)抗菌脂肽性能