呂路芳， 謝文惠， 姜 寧， 張愛忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319）

乳果糖（4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖）是由一分子果糖和一分子半乳糖，通過β-1,4-糖苷鍵結合的不易消化的雙糖（Wang等，2013）。作為人工合成的雙糖，乳果糖的合成主要通過化學異構法和酶法催化，但這兩種方法都有其局限性。考慮到合成的可行性和環(huán)境因素，相比于化學異構化，以酶法催化合成乳果糖更具吸引力。乳果糖在人類食品中已被廣泛應用，在肉雞生產(chǎn)中應用較少，因此本文介紹了化學法和酶法催化（例如糖苷酶和糖基轉移酶）生產(chǎn)乳果糖，并對乳果糖在肉雞生產(chǎn)中的應用進行了總結，同時對乳果糖生產(chǎn)技術未來的發(fā)展進行了展望，以期為乳果糖在畜禽等方面的后續(xù)開發(fā)與利用提供一定的理論基礎。

1 化學法合成乳果糖

1.1 化學異構化合成乳果糖 早在 1895年，Lobry de Bruyn和Van Ekenstein發(fā)現(xiàn)還原性糖在堿性溶液中會發(fā)生異構化反應生產(chǎn)非還原性糖，此類堿催化的醛糖-酮糖異構化反應被稱為洛布雷·德·布律-?？鲜┨┮蜣D化反應 （沈秋云，2015）。1929年，Montgomery通過使用弱氫氧化鈣溶液（石灰水）對乳糖異構化合成了乳果糖。乳糖化學異構化為乳果糖方法，其過程可以使用酸（石灰，硫酸）、堿（三乙胺、氫氧化鈉、氧化鎂和亞硫酸鹽）和兩性催化劑 （羥基、亞硫酸鹽和硼酸鹽）（Aider等，2007）。 通過洛布雷·德·布律-埃肯施泰因轉化反應將葡萄糖異構化成果糖基 （圖1）（Schuster等，2010），基本原理為還原性乳糖在熱處理過程中，經(jīng)過化學催化劑的催化作用，將乳糖上的葡萄糖直接異構化為果糖從而得到乳果糖。

1.2 電化學反應合成乳果糖 已有研究表明，在電化學催化方法的基礎上可以電活化合成乳果糖（Ait等，2014）。通過高濃度堿在反應介質中自動發(fā)電，這種方法被認為是一種新型節(jié)能技術。然而，這種技術產(chǎn)率遠遠低于化學異構化合成產(chǎn)率，所以在電化學反應合成乳果糖的研究至今還比較少。

2 酶法催化合成乳果糖

用于乳糖轉化成乳果糖的催化劑必須很容易從最終產(chǎn)物中去除，并且安全無毒和廉價環(huán)保。因此，酶法催化合成乳果糖是一個好的選擇。目前有兩種酶類能夠催化乳果糖合成，即糖苷水解酶與纖維二糖差向異構酶（Mayer等，2004）。這兩類酶中，糖苷水解酶（如β-半乳糖苷酶）更適于工業(yè)生產(chǎn)，其在市面上已有銷售，且價格低廉，已被廣泛應用于食品行業(yè)，特別是無乳糖乳制品中。

圖1 葡萄糖異構化成果糖基示意圖（Schuster等，2010）

2.1 通過β-半乳糖苷酶催化合成乳果糖 β-半乳糖苷酶又稱乳糖酶，是乳糖水解酶，可催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，在乳糖水解過程中，乳糖本身也可以作為一個受體，與此同時，也會產(chǎn)生低聚半乳糖（GOS）。β-半乳糖苷酶首先作用于乳糖釋放葡萄糖并形成酶-半乳糖中間復合物，當半乳糖基受體是水時形成半乳糖，當受體是果糖時則發(fā)生轉半乳糖基反應而得到乳果糖。因此，乳果糖是通過轉半乳糖苷酶催化乳糖和果糖合成的，高濃度的乳果糖通過某些酶 （如β-半乳糖苷酶）的作用容易發(fā)生次級水解成半乳糖和果糖。

2.2 微生物酶對乳果糖的轉糖基作用 從乳糖和果糖酶促合成乳果糖早在1978年已有報道，當時Vaheri和Kaupinnen利用脆壁酵母β-半乳糖苷酶催化乳糖的轉糖苷反應，乳果糖的產(chǎn)量達到7.8 g/L，得率只有3%左右。除了果糖之外，其他的親核試劑，如水、乳糖和低聚半乳糖都可以作為水溶液中乳果糖的合成所產(chǎn)生的半乳糖基受體。通過這些受體之間的競爭，對反應選擇性和得率都有很大的影響（Panesar等，2011）。

酶的濃度也顯著影響反應速率。Sitanggang等（2016）研究得出，在較高的酶濃度下（＞15 U/mL），原發(fā)性水解（乳糖水解）和次級水解（乳果糖水解）降解更快；此外，該研究還表明必須考慮酶濃度與乳糖初始量的比值以提高反應速率，提出了用互補酶使葡萄糖異構化合成果糖的方法，因為其是動力學控制，次級水解后所得的乳果糖濃度達到最高。

同時應該避免次級水解而增加的非生產(chǎn)性時間，使乳果糖持續(xù)合成，例如：酶膜反應器（EMR）、微通道（MC）或填充床反應器（PBR）（Sitanggang等，2014）。特別是在EMR固定體積下，沒有固相酶也可以持續(xù)合成乳果糖。酶分子可以保留在柱子內(nèi)的膜上，同時使產(chǎn)品、副產(chǎn)品和底物滲透下來。EMR系統(tǒng)的連續(xù)運行，可以改善連續(xù)生產(chǎn)中因為次級水解而使乳果糖降解的問題。也有很多研究利用PBR使乳糖（乳清蛋白）和果糖連續(xù)合成乳果糖。一種新型的具有激活壁的微通道系統(tǒng)被認為是一種可替代乳果糖連續(xù)合成的新技術，然而，微反應器的活性壁的制備比較復雜。有相關研究得出在微反應器中，用功能化多壁碳納米管固定的β-半乳糖苷酶催化合成乳果糖，48 h內(nèi)乳果糖的濃度保持在1.29 g/L（Song等，2012）。

2.3 通過纖維二糖差向異構酶合成乳果糖 低反應收率和在功能性食品市場對乳果糖的需求增加，要求我們需要進一步研究生產(chǎn)乳果糖更加便宜的酶催化劑。有相關研究報道纖維二糖差向異構酶可以催化β-1,4-糖苷鍵連接的低聚糖還原端 D-葡萄糖基差向異構化為 D-甘露糖基（Park等，2011）。有些纖維二糖差向異構酶還可以催化還原端 D-葡萄糖基異構化為D-果糖基，即可以催化乳糖轉化為乳果糖。Kim等（2012）用糖熱解纖維素果汁桿菌纖維二糖異構酶（CsCE）催化乳糖反應，在確定的最適條件（pH 7.5，80 °C，700 g/L乳糖）下，乳果糖產(chǎn)量可達 408 g/L，乳果糖的轉化率為58%，同時有約15%的底物乳糖轉化為依匹乳糖。另有研究在CsCE催化乳果糖合成的反應體系中加入硼酸鹽 （摩爾比，硼酸鹽∶乳糖=1∶1），乳果糖的產(chǎn)量提高到 616 g/L，轉化率提高到88%（Kim 等，2013）。Shen 等（2016）采用隨機誘變CsCE產(chǎn)生纖維二糖差向異構酶，經(jīng)過四次連續(xù)的隨機突變和篩選，得到一個最佳的G4-C5突變酶，這個G4-C5突變酶可以使乳果糖合成收益率為76%，并且在異構化的時候不會產(chǎn)生依匹乳糖。乳果糖在合成的過程中，純化有一定程度的復雜性。最近研究表明，乳糖通過異構化合成乳果糖的最佳條件是80°C，pH為7.5的Hepes緩沖溶液。在此條件下，乳果糖在90 min內(nèi)濃度迅速增加，在3 h內(nèi)達到穩(wěn)定狀態(tài)，雖然是分批合成，但并沒有觀察到乳果糖有分解的現(xiàn)象 （Shen等，2016）。

通過利用CsCE合成乳果糖，酶法催化與化學異構化反應的產(chǎn)率基本一致。以隨機誘變的方法生產(chǎn)G4-C5酶，并在EMR固定體積下進行連續(xù)操作，酶法催化合成乳果糖可能比化學異構化更有效?？梢院喕蛛x回收乳果糖的步驟，從而降低生產(chǎn)成本，但是，為了使其能夠工業(yè)化生產(chǎn)，必須建立酶 （例如G4-C5纖維二糖差向異構酶）的工業(yè)生產(chǎn)；此外，乳果糖作為功能性食品，其生產(chǎn)所用必須僅限于具有 （一般公認安全）（GRAS）和（食品及藥物管理局）（FDA）的認定，這些限制性問題希望在未來的研究中能夠解決。

3 乳果糖在肉雞生產(chǎn)中的應用

乳果糖對雙歧桿菌具有增殖效果，在食品工業(yè)中往往被作為功能性食品添加劑或雙歧因子使用。乳果糖是一種合成的二糖，不被胃腸道自身的酶分解，進入小腸后被雙歧桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶分解而成為雙歧桿菌的碳源，促進雙歧桿菌的生長，酸化腸道環(huán)境，降低腸道還原電位，抑制有害菌生長。乳果糖還被歐盟飼料和食品質量安全管理局（Quality and Safety of Feeds and Food for Europe；European Commission 2011）認定為一種新型飼料添加劑，其可通過促進雙歧桿菌和乳酸桿菌增殖，抑制沙門氏菌的生長，提高肉雞對腸道疾病的免疫力，從而減少抗生素在飼料中的使用（鄭排云等，2017）。

3.1 乳果糖對肉雞生產(chǎn)性能和屠宰性能的影響黃海濱等（2012）研究表明，添加不同水平乳果糖替代飼用抗生素后肉仔雞的活體重、平均日增重、平均日采食量較抗生素組均有所提高，較陰性對照組均有降低料重比的趨勢；添加0.5%、1.0%乳果糖的肉仔雞宰前活重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、腿肌重均優(yōu)于抗生素組，并且添加0.5%、1.0%的乳果糖在一定程度上降低了肉仔雞的脂肪沉積；綜合乳果糖對肉仔雞生產(chǎn)性能及胴體品質的影響，其中以1.0%乳果糖替代飼用抗生素的效果較佳。李虎等（2011）研究報道，在黃羽肉雞基礎日糧中添加不同劑量的乳果糖，能達到與添加抗生素相當?shù)男Ч瑥钠谀┢骄w重、平均日增重、平均日采食量、料重比、死亡率等因素綜合評價，在黃羽肉雞日糧中添加5 g/kg的乳果糖可以替代飼用抗生素；79日齡時活體重、屠體重、全凈膛重、半凈膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重方面與添加飼用抗生素組相比有升高趨勢；屠宰率、半凈膛率、腿肌率方面與用抗生素組效果相當；全凈膛率、胸肌率方面，與飼用抗生素組相比略有降低。就屠宰性能方面而言在黃羽肉雞基礎日糧中添加5 g/kg乳果糖可以替代飼用抗生素。Gheisar等（2016）在基礎日糧中添加0.25%和0.5%的乳果糖，結果表明在肉仔雞8～21日齡、21～35日齡和0～35日齡，都能顯著提高平均日增重 （P＜0.05）和降低料重比（P＜0.05），飼喂添加水平為0.5%乳果糖的肉仔雞胸脯肉相對重量高于其他組，滴水損失率下降（P＜0.05）。

3.2 乳果糖對肉雞腸道菌群和腸道黏膜形態(tài)的影響 崔彪等（2012）研究表明，在基礎日糧中添加5 g/kg乳果糖替代黃羽肉雞飼用抗生素與陰性對照組相比，乳果糖組腸道內(nèi)容物中細菌數(shù)量及回腸內(nèi)容物總酸的濃度提高，腸黏膜蛋白質中溶菌酶的含量、十二指腸黏膜蛋白質中SIgA含量提高，并且這種作用在45日齡時強于77日齡。唐倩等（2012）研究結果顯示在日糧中添加不同水平乳果糖在一定程度上促進了小腸對營養(yǎng)物質的吸收和利用，顯著提高了十二指腸、空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度，乳果糖使腸道內(nèi)容物中的丁酸含量增加，有利于肉仔雞腸道結構和功能的發(fā)育和修復受損后的腸道，其中以1.0%的添加量最好。Zhao等（2016）研究結果表明，飼喂0.15%乳果糖降低了14日齡糞便中的大腸桿菌數(shù) （P＜0.05），提高了14和35日齡糞便中的乳酸菌數(shù)（P＜0.05）。Calik等（2015）在以玉米-豆粕基礎日糧中添加 0%、0.2%、0.4%、0.6%和 0.8%的乳果糖，在42日齡時，添加不同水平乳果糖的腸道杯狀細胞與空白對照組相比無明顯差異，對盲腸中各菌群并沒有起到飲食治療的作用。7日齡和42日齡時測得肉雞的總揮發(fā)性脂肪酸結果顯示乳果糖能顯著增加和補充乙酸、丙酸和丁酸的濃度。

4 總結與展望

由于功能性食品市場對乳果糖的需求不斷增加，應該對如何經(jīng)濟有效地合成乳果糖作出更多研究。通過纖維二糖異構酶固有的催化能力，與化學異構化法相比乳糖異構化合成乳果糖與其反應產(chǎn)率相同，且不會產(chǎn)生副產(chǎn)物（依匹乳糖）。建議使用CsCE G4-C5纖維二糖差向異構酶EMR固定體積，可以簡化乳果糖的分離和純化過程，與化學異構化相比，這可以降低生產(chǎn)成本。為了經(jīng)濟有效的合成乳果糖，應該對異構酶制劑安全問題及其商業(yè)可用性進行更深入的研究。