黃 艷 ，羅定強(qiáng) ，李 青 ，袁芬越

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061； 2.陜西東泰制藥有限公司，陜西 咸陽 712000）

乙肝靈膠囊是由大黃、白芍、茵陳、柴胡、貫眾、甘草、人參、黃芪8味中藥材組方的中藥復(fù)方制劑，有清熱解毒、疏肝健脾的功效，適用于肝氣郁滯、濕邪困脾及乙型病毒性肝炎。方中大黃、白芍為君藥。大黃苦、寒，瀉熱通便，利膽逐瘀；白芍苦酸，微寒，養(yǎng)陰和血，柔肝止痛。兩者配伍，清利疏養(yǎng)并舉。該藥品現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZA17522005－2009Z，其存在部分薄層色譜重現(xiàn)性差、斑點(diǎn)不清晰，且對大黃未進(jìn)行含量控制的問題。陳光芝等[1]采用高效液相色譜（HPLC）法測定了乙肝靈膠囊中芍藥苷含量，而其他藥味未見文獻(xiàn)報(bào)道。為有效控制乙肝靈膠囊的質(zhì)量，本研究中在對原有鑒別項(xiàng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，對大黃、人參的薄層色譜（TLC）法進(jìn)行了修訂，增加甘草的TLC鑒別和大黃中土大黃苷的薄層色譜檢查，用HPLC法測定大黃中大黃素和大黃酚的總量，以實(shí)現(xiàn)對乙肝靈膠囊質(zhì)量的有效控制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.2 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，2489紫外檢測器，Empower工作站（美國 Waters公司）；AE204型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

大黃對照藥材（批號為 121676－201201），大黃酸對照品（批號為110757－200206），大黃酚對照品（批號為 110796－201520，含量為 99.2%），人參皂苷 Rb1對照品（批號為 110704－201424），人參皂苷 Re對照品（批號為 110754－201324），甘草對照藥材（批號為120904－201318），土大黃苷對照品（批號為 110794－201306），大黃素對照品（批號為 110796－200110），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙肝靈膠囊（陜西省東泰制藥有限公司，批號分別為 6B01，6B02，6B03）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇為色譜純（美國Honeywell公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

大黃[2]23，495：取含量測定項(xiàng)下的供試品溶液作為供試品溶液。另取50 mg大黃對照藥材，置具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，45 min水浴回流提取，濾過，蒸干濾液，殘?jiān)尤?%鹽酸溶液10 mL，于沸水浴中加熱1 h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移溶液置分液漏斗中，用30 mL乙酸乙酯分3次提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為對照藥材溶液。再取大黃酸對照品、大黃酚對照品，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 g／L的溶液，作為對照品溶液。按處方比例、工藝制備取不含大黃藥材的陰性樣品0.8 g，按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照TLC法（2015年版《中國藥典（四部》通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各6 μL，對照藥材溶液和對照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與大黃對照藥材溶液色譜和大黃酸、大黃酚對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 大黃的薄層色譜圖

人參[2]468,[3－4]：取本品內(nèi)容物 6 g，置索氏提取器中，加適量乙醚，加熱回流至提取液無色，棄去乙醚液，揮干藥渣，再加入100 mL甲醇，加熱回流至提取液無色，放冷至室溫，提取液蒸干，用30 mL水分次溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用90 mL水飽和的正丁醇分3次振搖提取，正丁醇提取液合并，用90 mL氨試液分2次洗滌，正丁醇液蒸干，用10 mL水溶解殘?jiān)?，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），按50 mL水、40 mL 40%乙醇和60 mL 70%乙醇的順序洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，用甲醇1 mL溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤?。另取人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品，分別用甲醇制成質(zhì)量濃度為1 g／L溶液，作為對照品溶液。按處方比例、工藝制備取不含人參藥材的陰性樣品6 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照TLC法（2015年版《中國藥典（四部）》通則0502）試驗(yàn)，上述3種溶液各吸取5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)及熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖2。

圖2 人參的薄層色譜圖

甘草[2]86，[5－7]：取本品內(nèi)容物 1.5 g，置具塞錐形瓶中，量入30 mL甲醇，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，用10 mL水溶解殘?jiān)?，調(diào)節(jié)pH至9～10，用60 mL水飽和的正丁醇液分3次提取，棄去正丁醇提取液，水液調(diào)節(jié)pH至2～3，用60 mL水飽和的正丁醇液分3次提取，提取液合并，用60 mL正丁醇飽和的水分次洗滌2次，蒸干提取液，用甲醇5 mL溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取甘草對照藥?.5 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再取按處方比例、工藝制備不含甘草藥材的陰性樣品1.5 g，同法制成陰性對照品溶液。照TLC法（2015年版《中國藥典（四部）》通則 0502）試驗(yàn)，取上述3種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，展開劑為乙酸乙酯 －甲酸 －冰醋酸 －水（15∶1∶1∶2），展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與甘草對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃綠色熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖3。

2.2 土大黃苷檢查[2]23，[8－11]

取本品內(nèi)容物1 g，置具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇，超聲處理 30 min（功率 500 W，頻率 40 kHz），濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取土大黃苷對照品，加甲醇制成0.1 g／L溶液，作為對照品溶液（臨用新制）。按處方比例、工藝制備的不含大黃藥材的陰性樣品1 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。取土大黃替代處方中大黃，然后取按處方比例、工藝所制備的陽性樣品1 g，同供試品溶液制備方法制成陽性對照品溶液。照 TLC法（2015年版《中國藥典（四部）》通則 0502）試驗(yàn)，上述4種溶液各吸取1 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，展開劑為三氯甲烷－甲醇－甲酸－水（11∶3∶0.2 ∶0.3），展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與土大黃苷對照品溶液色譜相應(yīng)位置上未出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。陽性對照品溶液色譜中，在與土大黃苷對照品溶液色譜相應(yīng)位置上出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)。詳見圖4。

圖3 甘草的薄層色譜圖

圖4 土大黃苷的薄層色譜圖

2.3 含量測定[12－15]

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent 5 TC －C18（2）柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 0.1% 磷酸溶液（68 ∶32）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃ ；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下，供試品溶液中大黃素色譜峰、大黃酚色譜峰與其他雜質(zhì)峰基線分離。色譜圖見圖5。

2.3.2 溶液制備

對照品溶液：取大黃素、大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成大黃素質(zhì)量濃度為10 μg／mL、大黃酚質(zhì)量濃度為20 μg／mL的混合溶液，即得。

供試品溶液：取樣品混勻的內(nèi)容物約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流45 min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置具塞錐形瓶中，蒸干，冷卻，加入8%鹽酸溶液10 mL，1 h沸水浴加熱，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用50 mL乙酸乙酯分次提取5次，合并乙酸乙酯液，蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

圖5 高效液相色譜圖

陰性對照品溶液：精密稱取按供試品處方比例、工藝制備的不含大黃的陰性樣品0.8 g，按供試品溶液制備方法制成，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取大黃素（11.70 μg ／mL）、大黃酚（19.58 μg ／mL）混合對照品溶液 2，5，10，15，20，25 μL，按擬訂色譜條件測定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得大黃素回歸方程 Y＝3 798.28 X＋ 271.54，r＝1.000 0（n＝6）；得大黃酚回歸方程 Y＝5 496.76 X＋4 577.04，r＝1.000 0（n＝6）。結(jié)果表明，大黃素和大黃酚進(jìn)樣量分別在 0.023 4～0.292 5 μg 和 0.039 16～0.489 60 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，進(jìn)樣6次。結(jié)果大黃素峰面積積分值的 RSD為0.49%（n＝6），大黃酚峰面積積分值的 RSD 為 0.85% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為6B02）樣品，精密稱取 6份，每份0.8 g，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，測定。結(jié)果大黃素平均含量為 0.413 2 mg ／g，RSD 為 1.57% （n＝6），大黃酚平均含量為 0.664 3 mg／g，RSD為1.81%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，記錄24 h。結(jié)果大黃素峰面積的 RSD為0.34%，大黃酸峰面積的 RSD為0.19%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號為6B02，大黃素含量為 0.413 2 mg ／g，大黃酚含量為 0.664 3 mg ／g）6份，精密稱定，每份0.4 g，分別精密加入25 mL大黃素、大黃酚混合對照品甲醇溶液（大黃素質(zhì)量濃度為7.656 μg ／mL，大黃酚質(zhì)量濃度為 11.088 μg ／mL），依法制備供試品溶液，測定。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.3.4 樣品含量測定

按擬訂色譜條件，取3批（批號分別為6B01，6B02，6B03）樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取 10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg／粒，n＝2）

3 討論

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對大黃的薄層鑒別只是以大黃酸、大黃酚對照品為檢驗(yàn)指標(biāo)，且供試品溶液色譜中大黃酸對照品斑點(diǎn)不清晰，對結(jié)果的判定有一定影響。本研究中增加了大黃對照藥材作為檢驗(yàn)指標(biāo)，以含量測定項(xiàng)下的供試品溶液作為該鑒別項(xiàng)的供試品溶液，優(yōu)化了薄層鑒別展開系統(tǒng)，考察了不同溫度、相對濕度下薄層色譜的展開情況，結(jié)果斑點(diǎn) Rf值適宜，方法耐用性良好。

對大黃素和大黃酚的總量測定，本研究中考察了提取方式、提取時間和水解時間，發(fā)現(xiàn)超聲處理45 min提取，沸水浴1 h水解，即可提取完全；水解后提取溶劑，比較了三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醚3種溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯與三氯甲烷提取率相當(dāng)，其供試品溶液色譜圖中預(yù)測定峰與其他成分能達(dá)到基線分離，因此提取溶劑采用毒性較小的乙酸乙酯。