陳 波 ，高 羽 ，余敏靈 ，朱敏鳳

（1.四川省成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610000； 2.四川省樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

中藥材種植及中藥飲片加工儲存過程中農(nóng)藥的不當(dāng)使用，均會影響中藥飲片質(zhì)量，危害人體健康[1]。2015年版《中國藥典（四部）》收載了多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的氣相色譜檢查方法[2]。近年來，農(nóng)藥殘留研究多以氣相色譜、液相色譜或其與質(zhì)譜的聯(lián)用為主[3－5]。本研究中根據(jù)色譜保留時間和質(zhì)荷比信息對樣品進(jìn)行定性分析，以樂果二級離子掃描色譜峰（125／79）面積為參照，計算其與敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185／93）面積和毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9／257.9）面積的校正因子，建立定量準(zhǔn)確測定百合[6]中樂果等3種農(nóng)藥殘留的一測多評方法，以期為測定農(nóng)藥殘留量提供一測多評[7－11]研究思路?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

敵敵畏、樂果、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號分別為GSB05－2298－2016， GSB05－2286－2016， GSB05－1849－2016），均為農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測保護(hù)研究所提供，規(guī)格均為100 μg／mL；乙腈、丙酮（北京百靈威科技有限公司）均為色譜純；氯化鈉、無水硫酸鈉（成都市科龍化工試劑廠）均為優(yōu)級純；百合樣品（四川龍馬藥業(yè)有限公司，批號分別為 20160516，20160721，20170815），由樂山市食品藥品檢驗檢測中心朱敏鳳主管中藥師鑒定為 Brown var.viridulum Bak的干燥肉質(zhì)鱗葉（百合Liliumbrownii F.E.），符合 2015年版《中國藥典（一部）》規(guī)定。

1.2 儀器

GCMS－TQ8030氣質(zhì)聯(lián)用儀（島津中國科技有限公司）；GC －MS／MS 7008 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國 Agilent公司）；TSQ 8000氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技公司）。色譜柱 1：Rxi－ 5SilMS，30 m ×0.25 mm，0.25 μm 毛細(xì)管柱（島津中國科技有限公司）；色譜柱 2：Rxi－5SilMS，30 m ×0.25 mm，0.25 μm 毛細(xì)管柱（美國 Agilent公司）；色譜柱 3：Rxi－ 5SilMS，30 m ×0.25 mm，0.25 μm 毛細(xì)管柱（美國 Restek公司）。電子天平（德國 Satorius公司）；Cleanert TPH凈化柱（天津博納艾潔爾公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定原理

利用樣品色譜圖中被測定物質(zhì)色譜峰相對保留時間進(jìn)行定位[2]和圖譜中二級離子碎片峰[樂果為47，62，79碎片離子峰（豐度比為 155∶13∶100，以 79為參比）、敵敵畏為 63，93，109（豐度比為 24 ∶100 ∶25，以 93為參比、毒死蜱為 194，258，286（豐度比為 24 ∶100 ∶49，以258為參比）]對樂果、敵敵畏、毒死蜱色譜峰進(jìn)行定性分析。精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液各適量，配制成不同質(zhì)量濃度的混合溶液，按設(shè)定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制樂果、敵敵畏、毒死蜱進(jìn)樣量對其峰面積的回歸曲線，以樂果回歸曲線斜率與敵敵畏、毒死蜱回歸曲線斜率的比計算校正因子（fsk＝Ks／Kk），通過樂果回歸曲線計算樂果含量，通過校正因子及樂果回歸曲線計算敵敵畏、毒死蜱含量[2]進(jìn)行定量分析。

2.2 溶液制備

取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用丙酮稀配置成每1 mL含樂果、敵敵畏、毒死蜱各10 μg的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品對照貯備液。取百合（批號為20160516）約50 g，粉碎過三號篩，稱取1.732 4 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，勻漿（15 000 r／min）提取 1 min，加入 2.5 g 氯化鈉，勻漿提取 1 min，離心（4 200 r／min）5 min，上清液置150 mL雞心瓶中，離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法勻漿提取1次，合并提取液，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL。加入約2 cm高無水硫酸鈉于Cleanert TPH固相萃取柱上，用正己烷－丙酮（6∶4）預(yù)洗10 mL，將濃縮液移入柱中，用正己烷－丙酮（6∶4）25 mL洗脫，洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用丙酮稀釋至1 mL，用0.2 μm濾膜過濾，即得供試品溶液；除稱取樣品外，按上述方法制備空白溶液。取供試品溶液制備項下百合粉末1.021 3 g，精密稱定，同法從“置50 mL離心管中起到收集洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干”轉(zhuǎn)移至 1 mL容量瓶中，加5 μL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，用 0.2 μm濾膜過濾，即得樣品加標(biāo)溶液。

2.3 測定條件

2.3.1 氣相色譜條件

色譜柱：Rxi－5SilMS毛細(xì)管柱（30 m ×0.25 mm，0.25 μm）；線速度：47.2 cm ／s；進(jìn)樣口溫度：250 ℃ ；程序升溫：50℃保持1 min，以25℃ ／min速率升至125℃，再以10℃ ／min速率升至300℃，保持 15 min；進(jìn)樣體積：1 μL；載氣：氦氣（純度大于 99.999% ）。

2.3.2 質(zhì)譜條件

接口溫度：250℃；離子源溫度：200℃；溶劑延遲時間：5 min；碰撞氣：氬氣（純度大于99.999%）。碰撞電壓設(shè)置和檢測離子選擇：敵敵畏母離子為185.0（碰撞電壓70 eV），子離子分別為93.0（碰撞電壓14 eV）、109.0（碰撞電壓 14 eV）、63.0（碰撞電壓 22 eV）；樂果母離子為125.0（碰撞電壓70 eV），子離子分別為79.0（碰撞電壓 8 eV）、47.0（碰撞電壓 14 eV）、62.0（碰撞電壓 10 eV）；毒死蜱母離子為313.9（碰撞電壓70 eV），子離子分別為 257.9（碰撞電壓 14 eV）、285.9（碰撞電壓 8 eV）、193.9（碰撞電壓 28 eV）。

2.4 圖譜解析

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液50 μL，置1 mL容量瓶中，加丙酮定容，作為對照品溶液。按2.3.1項下色譜條件，取對照品溶液、供試品溶液、樣品加標(biāo)溶液、空白溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果在對照品溶液二級離子掃描色譜圖中，有敵敵畏二級離子掃描峰（185／93）、樂果二級離子掃描峰（125／79）和毒死蜱二級離子掃描峰（313.9／257.9）， 保 留 時 間 分 別 為 5.690， 10.663，13.191 min，在空白溶液色譜和供試品溶液色譜中無上述色譜峰，在樣品加標(biāo)溶液色譜中有和對照品溶液色譜保留時間一致的敵敵畏、樂果和毒死蜱二級離子掃描色譜峰，詳見圖1。對照品溶液和樣品加標(biāo)溶液的二級離子碎片圖譜中敵敵畏在 63，93，109 處（豐度比為 24 ∶100 ∶25），樂果在 47，62，79 處（豐度比為 155 ∶13 ∶100），毒死蜱在194，258，286 處（豐度比為 24 ∶100 ∶49），有二級離子碎片峰，詳見圖2。

2.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液10，20，40，50，60，80，100 μL，分別置 7 個 1 mL 容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，按2.3.1項下色譜條件測定。以各組分二級離子掃描峰面積（A）與進(jìn)樣量（m，ng）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表1。

f值和 t值測定與耐受性考察：校正因子 f敵／樂＝2 016 535 ／615 311＝3.277 3，f毒／樂＝1 278 304／615 311 ＝2.077 5；相對保留時間 t敵／樂＝5.690／10.663＝0.533 6，t毒／樂＝13.191／10.663＝1.237 1。實(shí)際應(yīng)用中，色譜儀、色譜柱、色譜條件的變化可能引起 f值變化，因此對不同儀器、不同色譜柱、線速度、進(jìn)樣體積可能影響 f值的因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明，f值的波動不大。詳見表2。

表1 線性關(guān)系考察、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗及檢出限確定結(jié)果

圖1 二級離子掃描色譜圖

精密度試驗：精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液40 μL，置1 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按2.3.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果見表1。

重復(fù)性試驗：精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液40 μL，分別置6個 1 mL容量瓶，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按2.3.1項下色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果見表1。

穩(wěn)定性試驗：取2.4項下樣品加標(biāo)溶液，按2.3項下測定條件分別在 0，2，4，8，12，14，16，20，24 h 時進(jìn)樣，結(jié)果樂果、敵敵畏、毒死蜱色譜峰峰面積變化不大。結(jié)果見表1。

圖2 二級離子碎片圖譜

表2 相對校正因子耐受性考察結(jié)果

檢出限確定：取2.4項下樣品加標(biāo)溶液，按2.3.1項下色譜條件測定，測得信噪比（S／N），以3倍 S／N計算檢出限、10倍 S／N計算定量限。結(jié)果見表1。

加樣回收試驗：取2.2項下樣品粉末9份，每份約1 g，精密稱定，分別置9個50 mL離心管中，分為3組，每組3份，第1組中每份加標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液40 μL，第2組中每份加標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液50 μL，第3組中每份加標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液60 μL，依法制備樣品溶液，取樣品溶液按2.3.1項下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，按回歸方程計算含量。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

2.6 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 20160516，20160721，20170815）樣品，各20 g，粉碎過三號篩，分別取約1 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，取供試品溶液按2.3.1項下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，按加樣回收試驗方法計算含量。結(jié)果3批樣品中敵敵畏、樂果、毒死蜱殘留量均為0。

3 討論

本研究證實(shí)了可以采用GC－MS／MS測定百合中樂果等3種農(nóng)藥殘留，對采用GC－MS／MS法測定樣品中物質(zhì)含量提供了一測多評、數(shù)字對照品等的試驗設(shè)計思路。一測多評法是以一種對照品，建立該成分與其他成分間的相對響應(yīng)因子，通過相對響應(yīng)因子來計算其他成分含量的一種質(zhì)量控制方法，具有成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，能有效解決多指標(biāo)質(zhì)量控制面臨的對照品短缺、不易獲得和檢測成本相對昂貴等問題。在試驗中，對多種藥材農(nóng)藥殘留的含量測定進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)由于中藥材含有多種成分，某些成分對測定會有一些干擾，故在測定具體某一品種時應(yīng)設(shè)計具體的試驗參數(shù)，并進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)論證。

當(dāng)色譜條件有細(xì)微改變時，相對保留時間有細(xì)微變化，但在本試驗中，被測定物質(zhì)的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認(rèn)，故對相對保留時間的耐受性沒有進(jìn)行考察。

儀器廠家建議進(jìn)樣體積不超過1 μL，在相對校正因子 f值耐受性考察時，對進(jìn)樣體積 0.9，1.0，1.1 μL時的 f進(jìn)行了比較，結(jié)果變化不大。

因乙腈對農(nóng)藥溶解度較大，可溶入的雜質(zhì)量適中，故選擇乙腈為提取液；在Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高無水硫酸鈉以除去樣品溶液及洗脫液中的水分。

質(zhì)譜分析檢測限可達(dá) 10－15～10－12mol數(shù)量級，適合于農(nóng)藥殘留的檢測，在定性分析時采用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜，電子轟擊離子化比較待測化合物質(zhì)譜圖譜確定化合物的成分。

GC －MS聯(lián)用法和 GC －串聯(lián) MS（MS／MS）聯(lián)用法既具有GC的高分離效能，又具有MS可鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可同時快速測定樣品中多種殘留農(nóng)藥及其衍生物。