龐 鵬，陳寅生 ，趙 穎

（江蘇省南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001）

活血散是我院臨床老中醫(yī)根據(jù)祖?zhèn)鞣絼┨釤?、精?jiǎn)而成的醫(yī)院制劑，臨床應(yīng)用時(shí)間長(zhǎng)，且安全、有效。但其使用過程中存在缺陷：含有動(dòng)物藥土鱉蟲，放置時(shí)間長(zhǎng)容易變質(zhì)；臨用時(shí)需要加飴糖調(diào)敷，容易掉藥和污染衣物，臨床使用不方便；因調(diào)制藥粉量不準(zhǔn)確，容易造成散劑使用劑量不準(zhǔn)，影響療效；順應(yīng)性差，散劑藥粉太粗，外敷有沙粒感，患者自覺不舒適，對(duì)皮膚有刺激性。以上諸多缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了活血散的使用，有必要尋求一種有效、便捷的現(xiàn)代劑型替代傳統(tǒng)劑型?；钛筒紕┦怯缮╅_發(fā)的新劑型，由地膚子、黃柏、天南星、地鱉蟲等藥味組方，具有活血化瘀、消腫止痛的功效，用于骨折、骨裂及軟組織挫傷等跌打損傷諸癥。本研究中采用薄層鑒別和含量測(cè)定方法來控制活血巴布劑的質(zhì)量，從而建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1290型超高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器（安捷倫公司）?；⒄溶諏?duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111575－200502）；地膚子、天南星、黃柏、地鱉蟲對(duì)照藥材均購(gòu)于安徽亳州永剛飲片廠有限公司，經(jīng)南京市中醫(yī)院李文主任中藥師鑒定，均符合藥典要求；活血巴布劑為醫(yī)院自制制劑，飲片均購(gòu)于安徽亳州永剛飲片廠有限公司，經(jīng)南京市中醫(yī)院李文主任中藥師鑒定，符合藥典要求；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

地膚子[1－2]：取活血巴布劑 1 片，加甲醇 50 mL，超聲處理30 min，濾液蒸干，定容至10 mL容量瓶，作為供試品溶液。按上述方法制備地膚子對(duì)照藥材溶液。取缺地膚子的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液適量，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑為二氯甲烷 － 甲醇 － 水（10 ∶4 ∶1.2），展開，取出，晾干，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。供試品溶液色譜中，斑點(diǎn)顯色清晰，陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1 A。

天南星[3－4]：取活血巴布劑 1 片，加乙醇 30 mL，冷浸24 h，濾過，濾液水浴濃縮至干，加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取天南星對(duì)照藥材2 g，按上述方法制備對(duì)照藥材溶液。取缺天南星的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液適量，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑為二氯甲烷∶甲醇（9∶1），顯色劑為10%磷鉬酸乙醇溶液。供試品溶液色譜中，斑點(diǎn)顯色清晰，陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1 B。

黃柏[5－6]：取活血巴布劑1片，加1% 醋酸甲醇溶液40 mL，于60℃超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。取黃柏對(duì)照藥材0.1 g，加1%醋酸甲醇20 mL，按上述方法制備對(duì)照藥材溶液。取缺黃柏的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各 5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷 －甲醇 －水（30∶15∶4）的下層溶液，置氨蒸氣飽和的展缸內(nèi)，展開。置紫外光燈（365 nm）下，供試品溶液色譜中，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1 C。噴以改良碘化鉍鉀試液，供試品溶液色譜中，斑點(diǎn)顯色清晰，陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1 D。

地鱉蟲[7－8]：取活血巴布劑 1 片，加甲醇 50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取土鱉蟲對(duì)照藥材1 g，按上述方法制備對(duì)照藥材溶液。取缺土鱉蟲的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，展開劑為甲苯－二氯甲烷－丙酮（5∶5∶0.5），置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，斑點(diǎn)顯色清晰，陰性對(duì)照有干擾。色譜圖見圖1 E。

圖1 薄層色譜圖

2.2 虎杖苷含量測(cè)定[9－10]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（2）柱 （250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱號(hào) 225 －1125；流動(dòng)相：乙腈 － 水（23 ∶77）；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm。理論板數(shù)（按《中國(guó)藥典（一部）》虎杖藥材項(xiàng)下）虎杖苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

取虎杖苷對(duì)照品，置五氧化二磷的干燥器內(nèi)減壓干燥24 h后，取出適量，精密稱定，加稀乙醇制成15 μg／mL的溶液，得對(duì)照品溶液。取貼劑的1／10，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱量，記錄，超聲30 min（功率為500 W）后取出，再稱量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺虎杖貼劑的1／10，置具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取缺虎杖的陰性對(duì)照品溶液，搖勻，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL。結(jié)果表明，在虎杖苷色譜峰處無干擾，詳見圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別精密吸取質(zhì)量濃度為15 μg／mL的對(duì)照品溶液 2，5，10，15，20 μL 進(jìn)樣，以峰面積均值（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝2.93 X＋3.24，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，虎杖苷進(jìn)樣量在30～300 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為15 μg／mL的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積平均值為453.6，RSD為0.27%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于10 h內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣 10 μL。結(jié)果峰面積平均值為 2 057，RSD為2.62%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取貼劑的1／4，加入稀乙醇25 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定含量。結(jié)果含量平均值為 5.66 mg／g，RSD 為 2.93%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密取相當(dāng)于原藥材0.04 g的貼劑，平行6份，加入質(zhì)量濃度為0.21 g／L的對(duì)照品溶液1.0 mL，依法制備供試品溶液，測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 虎杖苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取貼劑的1／4，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果3 批樣品（批號(hào)分別為 150227，150316，150413）虎杖苷含量分別為 10.72，10.82，10.82 mg，平均 10.79 mg， RSD為0.49%（n＝3）。最終確定成品中虎杖苷的含量應(yīng)不少于每貼5 mg。

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)選擇

2015年版《中國(guó)藥典（一部）》虎杖藥材項(xiàng)下含量測(cè)定的檢測(cè)成分分別為大黃素和虎杖苷，大黃素的藥理功效為抗腫瘤活性、抗微生物生長(zhǎng)、免疫抑制、解痙止咳、降壓、利尿、瀉下等[11－12]，虎杖苷的藥理功效為鎮(zhèn)咳、調(diào)血脂、降低膽固醇、抗休克等[13－14]?；⒄溶盏膶傩詮?qiáng)，其他藥材少有含有效成分虎杖苷，同時(shí)虎杖苷樣品處理簡(jiǎn)單，處理過程中可減少有效成分的損失，重復(fù)性強(qiáng)，故檢測(cè)指標(biāo)選用虎杖苷。

3.2 展開劑選擇

活血巴布劑中地膚子、天南星、黃柏、地鱉蟲的薄層鑒別斑點(diǎn)均顯色清晰。其中地膚子中采用藥典法時(shí)發(fā)現(xiàn)展開劑極性較大，通過調(diào)整溶劑及比例，最終確定以二氯甲烷－甲醇 －水（10∶4∶1.2）的下層溶液為展開劑時(shí)，重復(fù)性好，斑點(diǎn)顯色清晰。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中天南星處理方法比較煩瑣，處理過程中會(huì)增加人為誤差，但樣品純凈度較高。

3.3 流動(dòng)相選擇

色譜柱選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，流動(dòng)相的比例略有變化，選擇3個(gè)比例分別為乙腈－水（22 ∶78），乙腈 － 水（23 ∶77）及乙腈 － 水（24 ∶76）?？紤]到圖譜中色譜峰的峰形及分離度，確定流動(dòng)相乙腈－水（23 ∶77）為最佳。

3.4 不足

由于活血巴布劑方中天南星既為有效藥味，又為有毒成分[15]，天南星的有毒成分是由其植物中所含有的特殊生物代謝產(chǎn)物草酸鈣針晶、草酸鈣針晶表面糖蛋白和微量的多糖組成。粉體粒徑降低，可破壞天南星科中的草酸鈣針晶，降低毒性，但是否會(huì)影響活血巴布劑的療效有待于進(jìn)一步研究。下一步將對(duì)天南星與地鱉蟲中有毒成分毒蛋白作進(jìn)一步研究，并通過相應(yīng)的藥理和毒理試驗(yàn)，以驗(yàn)證活血巴布劑的有效性和毒性。