符海郯 ，汪 慧 ，劉亞麗

（1.長江航運(yùn)總醫(yī)院·武漢腦科醫(yī)院，湖北 武漢 430019； 2.湖北省武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430075）

中藥成方制劑藥味復(fù)雜，僅憑單一成分測定不能全面、綜合地評(píng)價(jià)其質(zhì)量，且受方劑的整體物質(zhì)群難以控制等因素的制約[1－2]，其質(zhì)量評(píng)價(jià)是研究難點(diǎn)[3]。相比傳統(tǒng)的藥材鑒別技術(shù)，中藥特征圖譜具有能運(yùn)用現(xiàn)代分析儀器進(jìn)行分析、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性良好等優(yōu)勢，可有效控制中藥質(zhì)量[4－5]，廣泛用于中藥材及其制劑的質(zhì)量控制，對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及現(xiàn)代化的構(gòu)建起著重要作用[6－7]。咳喘寧顆粒由麻黃、紫菀 、百部、甘草、苦杏仁5味中藥組方，具有止咳化痰之功效，可用于傷風(fēng)感冒，急、慢性支氣管炎等病癥。已知的咳喘寧顆粒質(zhì)量研究多為單味藥材、單個(gè)成分的薄層鑒別分析[8]，尚無關(guān)于咳喘寧顆粒特征圖譜研究的報(bào)道。本研究中根據(jù)咳喘寧顆粒處方藥味的組方、成分特性，以期建立一個(gè)科學(xué)、可行的特征圖譜方法，整體評(píng)價(jià)不同企業(yè)的原藥材、投料及制劑的質(zhì)量狀況。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000分析型高效液相色譜儀（戴安公司），包括 LPG－3400SD四元泵，WPS－3000SL ANALYTICAL自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC－3000SD柱溫箱，DAD－3000二極管陣列檢測器；XS105DU型電子天平（十萬分之一，Mettler Toledo公司）；CLXXXUVM2型超純水系統(tǒng)（ELGA公司）；SK250LHC型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)。

麻黃、苦杏仁、紫菀、百部、甘草對(duì)照藥材，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品,均由中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)分別為121051－200801， 121554－200607， 120956－201107，121221－201009， 120904－201319， 171241－201101，171237－201211， 110820－201512， 111610－201006，110731－201306；咳喘寧顆粒由2個(gè)廠家提供，共22批，詳見表1；乙腈（色譜純，Merck公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 咳喘寧顆粒樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Tech Mate C18－ST柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈（A） －0.1% 磷酸（B），梯度洗脫程序見表 2；檢測波長：207 nm（0～40 min），237 nm（40～55 min）；流速:0.9 mL ／min；柱溫:30 ℃。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

稱取裝量差異項(xiàng)下的樣品適量，置研缽，研勻，取粉末5 g，精密稱定，置標(biāo)示量為50 mL的容量瓶中，加甲醇 40 mL，超聲處理（功率為 100 W，頻率為 50 kHz）30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

分別取麻黃、苦杏仁、紫菀、百部、甘草對(duì)照藥材適量，按照處方比例及制備工藝制成藥材提取物，按供試品溶液制備方法配制成對(duì)照藥材溶液。

分別取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷和甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷和甘草酸銨的質(zhì)量濃度均為 10 μg ／mL、苦杏仁苷的質(zhì)量濃度為 30 μg ／mL的對(duì)照品溶液。

按照處方比例及制備工藝分別制備不含麻黃、苦杏仁、紫菀、百部、甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法配制陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為150502），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄特征譜圖，以1號(hào)峰（鹽酸麻黃堿）為S1峰，計(jì)算1號(hào)～2號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間；以6號(hào)峰（甘草苷）為S2峰，計(jì)算3號(hào)～9號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD均小于2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為150502），依法平行制備供試品溶液5份，按擬訂色譜條件各進(jìn)樣1次，記錄特征譜圖。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD均小于2%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為150502），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，分別于 0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄特征圖譜。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD均小于2%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 特征圖譜的建立及其共有特征峰的歸屬

共有峰確定：分別精密吸取對(duì)照藥材溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，共有9個(gè)特征峰，分別表征處方中的麻黃、苦杏仁、百部和甘草，處方中的紫菀未找到相應(yīng)的色譜峰進(jìn)行表征，確認(rèn)了1號(hào)、2號(hào)峰來源于麻黃，3號(hào)、5號(hào)峰來源于百部，4號(hào)峰來源于苦杏仁，6～9號(hào)峰來源于甘草。色譜圖見圖1。

對(duì)照品對(duì)照法：照擬訂色譜條件，對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，并對(duì)9個(gè)共有峰進(jìn)行DAD掃描。通過采用對(duì)照品色譜峰結(jié)合DAD掃描圖譜的方式，確定了1號(hào)峰為鹽酸麻黃堿，2號(hào)峰為鹽酸偽麻黃堿，4號(hào)峰為苦杏仁苷，7號(hào)峰為甘草苷，9號(hào)峰為甘草酸銨。詳見圖2。

特征圖譜共有模式的建立及分析：通過對(duì)22批供試品特征圖譜的分析，建立咳喘寧顆粒特征圖譜共有模式，以鹽酸麻黃堿為參比峰1，計(jì)算峰1～峰2的相對(duì)保留時(shí)間；以甘草苷為參比峰2，計(jì)算峰3～峰9的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果22批樣品中特征峰的相對(duì)保留時(shí)間均在規(guī)定值 ±5% 內(nèi)：1.000 min（峰 1，鹽酸麻黃堿，S1），1.046 min（峰 2），0.550 min（峰 3），0.740 min（峰 4），0.855 min（峰 5），0.990 min（峰 6），1.000 min（峰 7，甘草苷，S2），1.200 min（峰 8），1.374 min（峰 9）。詳見圖3、表3和表4。

圖1 特征圖譜

圖2 特征峰DAD掃描圖

圖3 22批咳喘寧顆粒特征圖譜共有模式

表3 22批供試品中共有峰相對(duì)保留時(shí)間及峰歸屬

2.5 咳喘寧顆粒特征圖譜相似度分析

表4 22批供試品相對(duì)保留時(shí)間（min）

分別將2個(gè)廠家的22批樣品導(dǎo)入2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)”進(jìn)行相似度分析。結(jié)果表明，A廠家的11批樣品與該企業(yè)樣品生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.933～0.999，B廠家樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.986～0.998，均大于0.90，說明2個(gè)生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品制備工藝均較穩(wěn)定，各樣品一致性較好。詳見表5。

3 討論

表5 A廠家和B廠家11批咳喘寧顆粒相似度分析結(jié)果

3.1 檢測波長選擇

咳喘寧顆粒中化學(xué)成分復(fù)雜，其紫外吸收波長各有所不同，2015年版《中國藥典（一部）》[9]中麻黃、苦杏仁和紫菀含量檢測波長分別為210，207，200 nm，甘草為237 nm。為了兼顧各類成分的同時(shí)測定，選用207 nm和237 nm進(jìn)行雙波長切換檢測，考察了2種切換方式，方式 1為 0～30 min 207 nm，30～55 min 237 nm；方式 2為 0～40 min 207 nm，40～55 min 237 nm。結(jié)果表明，切換方式2所得到的色譜峰信息較豐富，故選用雙波長切換方式2作為試驗(yàn)方法。

3.2 樣品提取方法選擇[10]

分別考察4種提取方法：70%甲醇超聲30 min，50 mL熱水溶解，純甲醇超聲30 min；甲醇－1%磷酸（70∶30）超聲30 min。結(jié)果表明，各提取方法得到的液相色譜圖差異不大，純甲醇超聲30 min得到的供試品溶液色譜圖基線最平整，且提取方法簡便，故選用其作為樣品提取方法。

3.3 流動(dòng)相選擇

考察了甲醇－0.1%磷酸（梯度洗脫）[11]、乙腈－0.1%磷酸（梯度洗脫）2種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)甘草在甲醇體系中色譜峰分離效果不好，且基線不夠平整，含有的特征圖譜信息量較少；但乙腈體系中各藥材色譜峰分離相對(duì)較好，且所含有的特征峰信息量較豐富。故選用乙腈－0.1%磷酸（梯度洗脫）作為流動(dòng)相。

3.4 參照峰選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，咳喘寧顆粒中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿容易受pH、室溫和柱溫改變的影響，其保留時(shí)間會(huì)產(chǎn)生漂移。因此，采用了2個(gè)參照物成分計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間。即以鹽酸麻黃堿峰為參比峰1，計(jì)算峰1～峰2的相對(duì)保留時(shí)間；以甘草苷峰為參比峰2，計(jì)算峰3～峰9的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間基本保持穩(wěn)定。

3.5 不同生產(chǎn)廠家咳喘寧顆粒的特征峰分析

通過對(duì)咳喘寧顆粒特征圖譜共有模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的咳喘寧顆粒間化學(xué)成分存在明顯差異：1）22批樣品按特征圖譜方法檢測，均檢出9個(gè)特征峰，符合規(guī)定，但A廠家樣品的圖譜整體較B廠家樣品的圖譜峰個(gè)數(shù)偏少，某些峰面積偏低，表現(xiàn)在百部的2個(gè)特征峰和甘草的4個(gè)特征峰。造成這一差異的原因，可能與各廠家投料的藥材質(zhì)量差異有關(guān)。2）A廠家樣品色譜圖中鹽酸麻黃堿（峰1）的峰面積大于鹽酸偽麻黃堿（峰2）的峰面積，而B廠家的樣品則相反。這與兩家企業(yè)所投麻黃的品種來源有關(guān)，通過文獻(xiàn)[12]調(diào)研與特征圖譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A廠家樣品所投的為草麻黃，B廠家樣品所投的為中麻黃，與企業(yè)調(diào)研了解的情況一致，二者均為麻黃的法定來源。

3.6 結(jié)語

本研究中通過建立咳喘寧顆粒特征圖譜，確定了9個(gè)具有鑒別意義的特征峰，指認(rèn)了鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷及甘草酸銨5個(gè)共有峰；通過雙波長切換檢測技術(shù)方法解決了咳喘寧顆粒中有效成分群紫外波長吸收差異大的問題。本方法靈敏度高、重復(fù)性好、可靠性強(qiáng)，可為咳喘寧顆粒質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)、有效的依據(jù)。