劉 峰，周向東 ，李 琪，劉美花，王 杰

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 ?？?570102）

黏液高分泌是慢性氣道炎癥的重要病理特征之一，過度分泌且表型異常的黏液?？蓪?dǎo)致難以緩解的氣道梗阻，從而使患者病情加重[1－3]。以往將常用祛痰類中藥如桔梗等的作用機(jī)制歸于惡心刺激效應(yīng)，但此種解釋無明確實驗支持。有研究證實，與苦味感知相關(guān)的苦味素受體（T2Rs）的激活具有加快黏液纖毛清除效率及舒張支氣管等多種積極作用[4－5]。同時，桔梗等苦味中藥的主要成分為此類受體的配體，故可考慮此祛痰類中藥的作用多為通過苦味素受體來實現(xiàn)。本研究中通過選用具有臨床意義的大氣可吸入顆粒，即PM2.5（particles with an aerodynamic diameter of less than 2.5 μm）作為實驗刺激因素來誘導(dǎo)氣道黏液高分泌的產(chǎn)生，探討了T2Rs對氣道上皮細(xì)胞黏蛋白（mucin，MUC）5AC蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，可為慢性氣道炎癥的治療提供新的思路?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：TEOM1405D雙通道顆粒物監(jiān)測儀（美國賽默飛公司，精度為 ± 1.0 μg ／m3）；TECAN sunrise remote 自動酶標(biāo)儀（奧地利）；TCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡（德國徠卡）；SW－CJ－2FD型超凈工作臺（江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司）；Smart Spec3000型紫外分光光度計（美國Bio－Rad）；DYY－Ⅲ33型水平電泳儀（北京六一儀器廠）；SWX－600BS型電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠）；Z 233MK－2型低溫超速離心機(jī)（德國Hermle）。

細(xì)胞與試藥：中藥單體化合物桔梗皂苷（西安開來生物工程有限公司，批號為20170829，純度≥98%）；人氣道上皮細(xì)胞株HBE16（上海復(fù)祥生物科技有限公司，批號為6089）；鼠抗 MUC5AC 45M1單克隆抗體（美國Chemicon公司）；HRP標(biāo)記羊抗兔多克隆IgG抗體（美國SantaCruz公司）；異硫氰酸（FITC）標(biāo)記羊抗鼠熒光素IgG，辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）；MMLV（重組鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶）第一鏈cDNA合成試劑盒（日本 TaKaRa公司）；兔抗鼠 T2R14多克隆抗體（英國 Abcam公司）；兔抗鼠 MUC5AC，GAPDH一抗（德國Calbiochem公司）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：將人氣道上皮細(xì)胞株HBE16置6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔4×105～5×105個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液2 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育，常規(guī)換液培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70% ～80%時進(jìn)行傳代。

PM2.5的采集及懸浮液的制作：PM2.5顆粒（河北省環(huán)境監(jiān)測中心所采集于河北省石家莊市新華區(qū)石太高速公路附近），所有顆粒物經(jīng)TEOM1405D雙通道顆粒物監(jiān)測儀濾過，使用虛擬沖擊器分離大細(xì)顆粒物和PM2.5，然后進(jìn)入雙通道，分別聚集于系統(tǒng)可更換的TEOM濾膜上。收集的PM2.5顆粒加入蒸餾水中，配置成50 g／L的懸浮液，于360℃下熱處理60 min，－20℃避光，保存，待用。

細(xì)胞分組：將培養(yǎng)結(jié)束的細(xì)胞分成4組。對照組：在無胎牛血清的1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；PM2.5組：在無胎牛血清培養(yǎng)液中加入終質(zhì)量濃度為 40 μg／mL的PM2.5懸液；PM2.5＋桔梗皂苷組：在無胎牛血清培養(yǎng)液中加入桔梗皂苷，使其終質(zhì)量濃度為200 mg／L，于24 h后加入終質(zhì)量濃度為40 μg／mL的 PM2.5懸液；桔梗皂苷組：在無胎牛血清培養(yǎng)液中加入桔梗皂苷，使其終質(zhì)量濃度為200 mg／L，持續(xù)24 h。之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再采集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，每組實驗重復(fù)6次。

MUC5AC蛋白含量測定：采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細(xì)胞中MUC5AC蛋白含量[6]，按試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和加樣。取各樣本100 μL，加入96孔酶標(biāo)板，于4℃濕盒內(nèi)過夜。胎牛血清室溫下封閉 1 h，加入鼠抗 MUC5AC 45M1單克隆抗體（1∶100，用含 0.05%Tween－20的 PBS液稀釋至 50 μL），于 37℃下孵育 1 h；加入辣根酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG（1∶10 000）100 μL，孵育1 h；經(jīng)過四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶顯色，測出各孔吸光度值（450 nm），得出MUC5AC蛋白含量的相對值。

細(xì)胞免疫熒光法觀察細(xì)胞中T2R14和MUC5AC蛋白表達(dá)：采用細(xì)胞免疫熒光法觀察。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄置培養(yǎng)液（PBS）漂洗3次。加入4%多聚甲醛，于室溫下固定 30 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3次。室溫下采用0.4%Triton－X 100反應(yīng)20 min，PBS液漂洗3次。于室溫下加入羊血清工作液，封閉30 min。棄置羊血清液，加入一抗為兔抗鼠T2R14多克隆抗體（1∶500）和鼠抗MUC5AC單克隆抗體（1∶500），于 4℃濕盒內(nèi)過夜，次日使用PBS液漂洗3次。加入二抗為FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG（1 ∶50），于室溫下置暗盒內(nèi)孵育 30 min，PBS 液漂洗3次。50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

RT－PCR法檢測細(xì)胞中 T2R14，MUC5AC mRNA水平[7]：采用Trizol法抽提各組細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度和在260 nm及280 nm波長處的吸光度值。引物由上海生物有限公司設(shè)計合成。各引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，緊跟34個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，之后 72 ℃下延伸10 min以補(bǔ)齊末端。酶切產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖電泳鑒定，溴化乙錠顯色。結(jié)果經(jīng)Bandleader軟件行光密度面積積分分析，以目的基因和GAPDH的光密度面積積分比值來表示。

表1 RT－PCR各目的基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s表示，多組間分析使用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞中MUC5AC蛋白含量

與對照組相比，PM2.5組細(xì)胞內(nèi)的MUC5AC蛋白分泌水平明顯增高（P＜0.01）。在PM2.5刺激前予桔梗皂苷預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)的MUC5AC蛋白分泌水平明顯低于單純的 PM2.5組（P＜0.01）。詳見表2。

2.2 T2R14和MUC5AC蛋白表達(dá)情況

與對照組相比，PM2.5組細(xì)胞內(nèi)的MUC5AC蛋白表達(dá)量明顯升高。在PM2.5刺激前予桔梗皂苷組細(xì)胞內(nèi)的MUC5AC蛋白含量低于單純的PM2.5組，同時T2R14蛋白表達(dá)水平升高。與對照組相比，桔梗皂苷組細(xì)胞內(nèi)的T2R14蛋白表達(dá)水平同樣升高。詳見圖1和圖2。

2.3 T2R14和MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄情況

與對照組相比，PM2.5組細(xì)胞內(nèi) MUC5AC的mRNA表達(dá)水平明顯增高（P＜0.01）。PM2.5＋桔梗皂苷組細(xì)胞內(nèi)MUC5AC的mRNA表達(dá)水平明顯低于PM2.5組（P＜0.01），同時，T2R14的 mRNA 表達(dá)水平較對照組升高（P＜0.05）。與對照組相比，桔梗皂苷組細(xì)胞內(nèi) T2R14的 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。詳見表2和圖3。

表2 各組MUC5AC的蛋白分泌結(jié)果和MUC5AC、苦味素受體的 mRNA表達(dá)（±s，n＝6）

表2 各組MUC5AC的蛋白分泌結(jié)果和MUC5AC、苦味素受體的 mRNA表達(dá)（±s，n＝6）

注：與對照組比較， P ＜0.05，＃P ＜0.01；與 PM2.5組比較，P ＜0.01。

組別對照組PM2.5組PM2.5＋桔梗皂苷組桔梗皂苷組MUC5AC的蛋白分泌0.227±0.005 0.779±0.004＃0.378±0.006 0.219±0.003 MUC5AC 0.283±0.009 0.784±0.006＃0.357±0.004 0.268±0.005 T2R14 0.256±0.004 0.243±0.008 0.534±0.006 0.557±0.009

圖1 各組T2R14的蛋白表達(dá)情況（激光共聚焦顯微鏡×400）

圖2 各組MUC5AC的蛋白表達(dá)情況（激光共聚焦顯微鏡×400）

圖3 各組MUC5AC和苦味素受體的mRNA表達(dá)水平

3 討論

氣道黏液高分泌是影響氣道炎癥性疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的重要因素。氣道病理性黏液產(chǎn)生的主要原因為黏蛋白的過度表達(dá)，至今已發(fā)現(xiàn)18種MUC基因，其中MUC5AC的過度表達(dá)在慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary desease，COPD）患者的病情進(jìn)展中具有重要的病理意義[8－10]。目前，臨床常使用中醫(yī)中藥輔助祛痰治療，常見的祛痰類中藥有桔梗、遠(yuǎn)志、前胡等，多數(shù)含有苦味成分?？辔段镔|(zhì)可改善痰液的理化性質(zhì)，使痰液較易咳出，但其作用機(jī)制目前無確切解釋。

人對苦味的感知與體內(nèi)存在的味覺感受器T2Rs的表達(dá)有關(guān)，已發(fā)現(xiàn)25個T2Rs受體亞型，人氣道上皮細(xì)胞表達(dá)較多的是 T2R10，T2R14，T2R31[11－14]。最新研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可使人膀胱平滑肌細(xì)胞的T2R14的表達(dá)增加，且白果的藥效物質(zhì)有奎寧、蘆丁對T2Rs的亞型T2R14受體具有明顯的激動作用[15－16]。推測桔梗皂苷可能通過激活人氣道上皮細(xì)胞T2Rs中的T2R14亞型促進(jìn)氣道黏液的分泌。本研究結(jié)果表明，PM2.5刺激后，MUC5AC的蛋白表達(dá)及mRNA水平較對照組顯著升高，提示PM2.5可以通過誘導(dǎo)MUC5AC高分泌的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)氣道黏液高分泌的形成。采用桔梗皂苷干預(yù)后，MUC5AC的蛋白表達(dá)及mRNA水平較PM2.5組下降顯著，提示桔梗皂苷對PM2.5誘導(dǎo)產(chǎn)生的MUC5AC高分泌具有抑制作用。各組T2R14的檢測結(jié)果顯示，桔梗皂苷T2R14的蛋白表達(dá)及mRNA水平較對照組升高?？梢?，桔梗皂苷可激活肺部T2R14的蛋白表達(dá)，可進(jìn)一步抑制PM2.5誘導(dǎo)的MUC5AC的高分泌，進(jìn)而達(dá)到抑制氣道黏液高分泌的目的。

目前，國內(nèi)外對肺部T2Rs的研究主要是針對舒張支氣管的作用[17]，而較少涉及抗炎作用。本研究結(jié)果確認(rèn)了T2Rs在治療氣道黏液高分泌方面的積極效應(yīng)。因此提示，T2Rs在治療氣道黏液高分泌方面的巨大潛在價值，進(jìn)而為慢性氣道炎癥性疾病氣道黏液高分泌的治療提供了新的詮釋機(jī)制和藥物干預(yù)靶點。