趙 陽 周秀艷 辛 明 秦智偉

（農業(yè)農村部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質資源創(chuàng)制重點實驗室，東北農業(yè)大學園藝園林學院，黑龍江哈爾濱 150030）

黃瓜是我國保護地栽培的第一大蔬菜作物，2015年全國栽培面積125.8萬hm2（沈辰 等，2017）。黃瓜的性別分化、花期的早晚對黃瓜的產量及上市的早晚有著不可忽視的影響，這些特點決定了黃瓜品種的經(jīng)濟價值。目前，黃瓜性別分化、花期及果實發(fā)育成為了研究的熱點。MADS-box基因是一類廣泛存在于植物中序列特異的同源異型基因，參與調控花和果實發(fā)育及成熟的多個過程。MADS-box基因作為轉錄因子含有一段高度保守的DNA結合結構域，通過該結構域MADS-box基因識別并結合在下游目標基因的特定靶位點，從而調控下游目標基因的表達（張則婷和李學寶，2007）。植物含有眾多MADS-box基因，如擬南芥有100多個MADS-box基因（De Bodt et al.，2003；Parenicov á et al.，2003），它們形成一個龐大的基因家族。根據(jù)系統(tǒng)進化關系、基因結構和蛋白結構的不同，MADS-box 基因分為I型（Type I）和II型（Type II）兩大類型（Becker & Theissen，2003）。Type I可 進 一 步 分 為Ma、Mβ、Mγ 和Mδ；Type II可進一步分為MIKCC和MIKC*（Henschel et al.，2002）。植物I型MADS-box基因研究較淺，已有的研究表明，該類型的基因主要參與雌配子體、胚胎和種子的發(fā)育進程，并與不同物種間生殖器官分界的決定有關（Masiero et al.，2011）。植物II型MADS-box基因研究比較深入，該類型的基因大多與花形態(tài)形成有關，如已知的ABCDE模型。黃瓜中共發(fā)現(xiàn)43種MADS-box基因。已有的研究表明黃瓜中不含有FLC、AGL12和Bs 3種亞型的MADS-box基因，并且除GL亞型外，黃瓜其他亞型的MADS-box基因與擬南芥等其他植物中基因具有相似的功能（Gan et al.，2014）。

本試驗在對黃瓜幾組不同花期的雜交組合田間花期調查的基礎上，由轉錄組測序并通過熒光定量驗證的方法獲得了1個黃瓜MADS-box家族的基因，通過生物信息學分析的手段來預測該基因的功能，以期為進一步基因功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黃瓜自交系D0708-2為父本（雌雄異花同株），自交系D1158♀-2（強雌系）、D1104-2-4（全雌系）、D0528-2（雌雄異花同株）為母本配制雜交組合。F1分別為東農812（D1158♀-2×D0708-2）、C15-114（D1104-2-4×D0708-2）、C17-31（D0528-2×D0708-2）。父母本及F1均由東北農業(yè)大學園藝園林學院黃瓜課題組提供，采用穴盤育苗并且于2017年7月幼苗兩葉一心時定植于東北農業(yè)大學園藝站塑料大棚。每小區(qū)2行，每行14株。隨機區(qū)組設計，3次重復。

逆轉錄酶、DNA聚合酶、d NTP、T/A克隆載體均購自TaKaRa公司，TRIzol購自Invitrogen公司，質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和熒光定量染料均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間性狀調查及轉錄組測序 于黃瓜開花初期、根瓜期、盛果期時每小區(qū)隨機抽取3株進行定株調查，分別考察各組合不同時期的雌花數(shù)、雌花節(jié)率、第1雌花節(jié)位及最高發(fā)育節(jié)位，最高發(fā)育節(jié)位指最頂端開放的花（不分雌花雄花）所在位置距離莖尖的節(jié)位。開花初期指黃瓜單株至少3朵花開放，小區(qū)內至少50%植株開花的時期；根瓜期指有50%黃瓜植株開始采收商品瓜的時期；盛果期指黃瓜單株商品瓜產量達到最大的時期（路洪鳳，2014）。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行整理，DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析。

通過田間試驗結果挑選1個組合進行轉錄組測序。測序及分析交由華大基因（深圳，中國）使用Illumina HiSeq平臺完成，參照數(shù)據(jù)庫 為 NCBI數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=cucumber）。

1.2.2 引物設計與合成 使用軟件Primer Premier 5.0（Premier Bio-soft International，Palo Alto，CA）設計克隆基因全長引物AGL62，并通過http：/biodb.swu.sdu.cn/qprimerdb網(wǎng)站下載熒光定量引物qAGL62，使用CsEF1α基因作為內參（Lu et al.，2018）?？寺∫锛盁晒舛恳镆姳?。1.2.3 CsMADS-box AGL62的克隆及熒光定量 PCR擴增體系為20.0μL，其中：10×PCR Buffer（含 20 mmol·L-1Mg2+）2.0 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）2.0μL，Taq 酶（2U）0.2μL，cDNA模板2.0μL，上下游引物各0.5μL，最后加12.8μL的ddH2O。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 1 min（表 1），72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，回收目的片段，連接到pGEM-T克隆載體上，采用熱激法轉化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，在氨芐抗性平板上進行藍白斑篩選，挑白色菌落搖菌后送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

表1 引物序列

熒光定量體系為20.0μL：染料SYBR Green PCR Master Mix 10.0μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O 7.0μL。熒光定量在BIO-RAD iQ5熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸步驟收集熒光信號，每個樣品設置4個技術性重復，3個生物學重復。采用2-ΔΔCT相對定量分析方法計算出基因的相對表達量，并用DPS 7.05 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行方差及顯著性分析。

1.2.4 CsMADS-box AGL62的生物信息學分析 通過 NCBI的 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對基因進行保守結構域的分析；利用MEGA 5.2對基因進行建樹分析。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）計算蛋白質的理論分子質量、理論等電點、原子組成、穩(wěn)定系數(shù)和脂肪系數(shù)。利用蛋白質亞細胞定位工具PSORT（http：//psort.hgc.jp/form2.html） 預 測 蛋 白 質 的 定位。通過SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）及 IPSORT（http：//ipsort.hgc.jp/）進行蛋白質信號肽預測。利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白質進行跨膜區(qū)域預測。通過 ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質的親水性與疏水性。用SOPMA（http：//sopma.expasy.org/）及 Phyre 2（http：//sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）對蛋白質的二級結構、三級結構進行預測。

2 結果與分析

2.1 田間調查結果

親本及F1調查結果見表2。從表中可以看出，3個時期的雌花數(shù)、雌花節(jié)率顯示了F1能夠很好地遺傳親本性狀，如D1158♀-2、D1104-2-4為雌性系，其雜種一代東農812和C15-114也為雌性系，并且C15-114的雌性表現(xiàn)比母本D1104-2-4還要突出（表2）。D0528-2為雌雄異花同株，雜種一代C17-31也為雌雄異花同株。

根據(jù)雜種優(yōu)勢指數(shù)的計算方法：

其中F1表示雜種一代，P1、P2表示親本，Hp表示親本中較優(yōu)良的親本，Mp表示雙親的中親值，OPH表示超親優(yōu)勢，MPH表示超中優(yōu)勢。

通過和非雌性系父本雜交，以強雌系D1158♀-2為母本的雜種一代東農812的雌花數(shù)和雌花節(jié)率均低于母本，這在3個時期表現(xiàn)一致（圖1），但由全雌系D1104-2-4作母本的C15-114在雌花數(shù)和雌花節(jié)率上產生了超親優(yōu)勢（圖1-A），表明利用全雌系可以獲得在雌性上具有雜種優(yōu)勢的新品種。但是通過雜交筆者并沒有獲得具有早花超親優(yōu)勢性狀的雜種一代（圖1-A），不過通過和具有早花性狀的親本雜交，F(xiàn)1能夠很好地綜合親本的優(yōu)良性狀兼具早熟和雌性的特點（圖1-B）。

表2 3個組合田間性狀表現(xiàn)

2.2 黃瓜MADS-box基因家族測序結果分析

根據(jù)田間調查結果，以D1104-2-4為母本，D0708-2為父本配制的C15-114組合在雌花數(shù)、雌花節(jié)率上具有超親優(yōu)勢，這一特點有利于研究黃瓜MADS-box基因家族在雌性雜種優(yōu)勢形成中的作用，因此挑選該組合進行轉錄組測序。

測序結果顯示（表3），黃瓜37個MADS-box家族基因中大部分基因在父母本及子代中無差異表達。C15-114和母本D1104-2-4之間MADS-box家族基因差異倍數(shù)在-3.20～7.04，其中31個基因無差異表達，只有6個有差異表達，其中1個基因差異顯著（差異倍數(shù)＞4）。而C15-114和父本D0708-2之間MADS-box家族基因差異倍數(shù)在-5.83～5.55，其中有17個基因差異表達，20個無差異表達（表3）。根據(jù)C15-114、D1104-2-4及D0708-2的性狀表現(xiàn)可知，C15-114、D11104-2-4屬于全雌系而D0708-2屬于雌雄異花同株，轉錄組的測序結果進一步體現(xiàn)了雜種一代的雌性偏向。

圖1 3個F1的超親及超中優(yōu)勢

圖2 黃瓜MADS-box家族基因轉錄組測序熱圖聚類分析

對黃瓜MADS-box家族基因進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，差異表達的基因富集在相似的類別中，上調差異表達的基因和下調差異表達的基因分別聚集在2組不同的分支中（圖2）。這表明雜種一代與親本雌性產生差異的結果是由于部分基因差異表達。為了進一步分析差異基因特點，對黃瓜37個MADS-box家族基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹并通過比對到黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.icugi.org/）分析各個基因的外顯子分布（圖3）。這些MADS-box家族基因的2種類型主要集中在2個區(qū)域（圖4）。說明黃瓜中該家族基因進化上具有很大的保守性。通過轉錄組測序得到的差異較大且在2個親本中差異表達相反的2個基因ID：101215235和ID：101206073均屬于Type Ι（ 圖 3、4）。ID：101215235有 1個外顯子區(qū)域，ID：101206073有2個外顯子區(qū)域，二者都屬于AGL62型。有研究表明，AGL62的基因功能與AGL61功能類似，AGL61可以與AGL80協(xié)作，共同參與雌配子體內中心細胞的分化（Bemer et al.，2008），并且AGL62同時還參與胚乳細胞的形成（Kang et al.，2008），這些都與植物的雌性分化密切相關。綜上分析表明：引起雜交種C15-114與親本間雌性差異及花期差異的原因很可能是這2個基因差異表達的結果。

為驗證這一結論的準確性，挑選ID：101215235基因在3個組合中進行熒光定量驗證分析（圖5）。將每個組合的雜種一代作為參照，C15-114組合中父母本與子代均有差異，母本表現(xiàn)為近5倍的差異表達量，父本表現(xiàn)為近3倍的差異表達量，熒光定量結果和轉錄組測序結果基本一致（表3，圖5）。分析發(fā)現(xiàn)2個雌性系組合父母本與雜種一代均有顯著差異表達，而非雌性系C17-31組合中父母本與雜種一代差異不顯著。表明基因ID：101215235在雜交組合中的差異表達可能參與黃瓜的雌性分化。

2.3 CsMADS-box AGL62基因克隆及分析

從黃瓜莖尖提取總RNA后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖6-A）。結果顯示RNA提取良好。進行PCR克?。▓D6-B）后在745 bp左右出現(xiàn)條帶，回收后與pGEM-T克隆載體相連轉化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，挑白色菌落搖菌后測序。測序結果與NCBI上基因ID：101215235序列一致，表明克隆成功。

Protparam分析結果顯示基因ID：101215235編碼的蛋白含有187個氨基酸；理論等電點為9.18；預測的分子量為21.583 kDa；分子式為C970H1541N267O278S6；不穩(wěn)定指數(shù)為54.96，屬于不穩(wěn)定蛋白（＞40屬于不穩(wěn)定）；脂肪族指數(shù)為84.49。NCBI比對結果表明該蛋白為MADS-box家族蛋白，類別為AGL62（圖7），并且具有SRF-TF結構域，所以基因ID：101215235還是1個轉錄因子，把該基因命名為CsMADS-box AGL62。PSORT預測結果顯示該蛋白可能為線粒體蛋白。

信號肽預測結果表明該蛋白沒有明顯的信號肽序列（圖8-A、B），而TMHMM跨膜區(qū)域預測發(fā)現(xiàn)該蛋白在第30～50個氨基酸位置有跨膜，表明該蛋白是膜蛋白，且前30個氨基酸位于膜內，第50個氨基酸之后位于膜外（圖8-C）。

表3 黃瓜MADS-box基因轉錄組測序結果

圖3 黃瓜MADS-box家族基因發(fā)育樹及外顯子分布

圖4 黃瓜MADS-box家族基因分類

圖5 ID：101215235基因在3個F1組合中的熒光定量結果

圖6 RNA提取及PCR電泳

圖7 CsMADS-box AGL62基因保守結構域

圖8 CsMADS-box AGL62蛋白信號肽及跨膜區(qū)域預測

圖9 CsMADS-box AGL62的疏水性及高級結構預測

圖10 CsMADS-box AGL62系統(tǒng)進化分析

對蛋白質的疏水性預測發(fā)現(xiàn)，主要的疏水位點為第30～50個氨基酸（圖9-A），該位點與跨膜預測結果中的跨膜位點一致。結合跨膜預測結果發(fā)現(xiàn)，氨基酸的膜外和膜內區(qū)域均為親水性氨基酸，這些結果均與跨膜蛋白特征相似。蛋白質的二級結構分析表明，該蛋白共有76個α螺旋，占整個多肽鏈的40.64%；28個延伸主鏈占整個多肽鏈的14.97%；10個β折疊占整個多肽鏈的5.35%；73個無規(guī)則卷曲占整個多肽鏈的39.04%（圖9-C）。用Phyre2同源建模預測蛋白的三級結構如圖9-B所示。

不同物種的AGL62亞型基因系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)黃瓜與甜瓜的同源性最高（圖10-A），不同物種不同亞型的MADS-box家族基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，同一個物種不同亞型的MADS-box家族基因進化程度更為相近（圖10-B）。結合圖3和圖4分析，CsMADS-box AGL62基因同一物種中相同的亞型具有最高的同源性，表明該基因在黃瓜進化中保守性很高。

3 討論

本試驗通過田間調查及轉錄組分析篩選出雜交種中與黃瓜雌花發(fā)育有關的差異表達基因，分析了MADS-box家族基因在黃瓜雜交種中的表達模式，并挑選1個該家族顯著差異的基因ID：101215235進行生物信息學分析，并命名為：CsMADS-box AGL62。

MADS-box家族在植物中參與性別決定與花發(fā)育的機理已經(jīng)有了深入的研究（Lin et al.，2015；Dreni & Zhang，2016；Zeng et al.，2018），但是該家族對植物雌性形成的雜種優(yōu)勢研究還很少。本試驗發(fā)現(xiàn)MADS-box家族基因在雜交組合中表達模式顯著偏向母本，這可能是F1的雌性相關農藝性狀與母本相似的原因。有研究發(fā)現(xiàn)MADS-box家族基因參與植物早花的形成（de Oliveira et al.，2014），在本試驗中發(fā)現(xiàn)所有的組合開花時間均介于母本與父本之間，并且更偏向父本，與雌花分化等性狀偏向母本相反。MADS-box家族基因在雜交種中的表達調控機理還有待進一步研究。

AGL62基因屬于MADS-box家族中I型基因，本試驗在黃瓜中獲得1個CsMADS-box AGL62基因。有研究表明，該基因調控胚乳的發(fā)育及細胞形成（Hehenberger et al.，2012），生物信息學分析表明，黃瓜中該基因位于線粒體膜上，屬于轉錄因子，這說明CsMADS-box AGL62基因可能在黃瓜中調控線粒體基因的表達。