余 辛馮黎霞章 柱武目濤李新浩丁 鈿

（1廣州機場出入境檢驗檢疫局，廣東廣州 510000；2廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510000）

番茄（Solanum lycopersicum）是全世界栽培最為普遍的茄果類蔬菜之一，近十年來全世界番茄的消費量以平均每年3%的速度增長。病毒病在世界各國番茄種植區(qū)普遍發(fā)生，嚴重威脅番茄的安全生產(chǎn)。目前，危害番茄的病毒有40余種（Hanssen et al.，2010），可通過種子攜帶的有南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、番茄黑環(huán)病毒（Tomato black ring virus，TBRV）等。在這些病毒中，TSWV、ArMV、ToRSV、TBRV等是我國禁止進境的檢疫性有害生物。

番茄斑萎病毒是布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的代表種，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上危害非常嚴重的病毒。Brittlebank（1919）最早在澳大利亞發(fā)現(xiàn)TSWV為害番茄，1965年TSWV在大麗菊上被首次分離出來后，研究人員相繼從青椒、番茄及多種觀賞植物上分離出該病毒。目前TSWV在歐洲、北美洲、南美洲、亞洲和大洋洲等多個國家和地區(qū)廣泛分布，熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)均有發(fā)生，是名副其實的全球性植物病害，被列為世界十大植物病害之一。TSWV的寄主范圍十分廣泛，能感染超過84科1 090種植物，寄主作物主要有煙草、花生、辣椒、萵苣、茄子等（Parrella et al.，2003）。20世紀80～90年代，TSWV在美國夏威夷、意大利、南非和巴西的流行導(dǎo)致當?shù)氐姆?、葉用萵苣（生菜）等作物近乎絕產(chǎn)（Wilson，1998；Pappu et al.，2009；Al-Saleh et al.，2014）。在有些年份，夏威夷萵苣作物因受TSWV破壞，經(jīng)濟損失達50%～90%（Cho et al.，1989）。近些年來，陸續(xù)在我國的四川、廣州、北京等地多種植物上發(fā)現(xiàn)TSWV的危害（許澤永 等，1988；姚革，1992；陳東亮 等，2018）。

近二十年來，基于抗原抗體反應(yīng)的血清學(xué)方法和基于PCR反應(yīng)的分子生物學(xué)方法發(fā)展非常迅速，已廣泛應(yīng)用于植物病原菌的檢測鑒定中，其中DAS-ELISA和RT-PCR因具有高度的專一性和靈敏度，又可在短時間內(nèi)得到結(jié)果，已成為檢測鑒定植物病毒的重要方法（金羽和文景芝，2005）。我國發(fā)布的番茄斑萎病毒檢疫鑒定國家標準GB/T 31802—2015規(guī)定了利用植物葉片進行TSWV檢測鑒定的方法和程序，TSWV陽性檢出的判定標準為：DAS-ELISA測定為陽性，同時RT-PCR或者實時熒光定量PCR測定為陽性。同時，科研人員也在不斷研究并建立快速可靠的TSWV檢測方法，Boonham等（2002）運用實時熒光定量PCR技術(shù)、吳興海等（2016）利用恒溫擴增技術(shù)等建立了TSWV快速檢測鑒定技術(shù)，劉忠梅等（2017）應(yīng)用DPO技術(shù)建立番茄斑萎病毒檢測方法，馮黎霞等（2017）從進境的生菜種子中檢測到TSWV。據(jù)報道，目前國內(nèi)外大多是針對番茄感病葉片或果實進行病毒檢測，國家標準GB/T 31802—2015中也要求采集葉片用于檢測番茄斑萎病毒。直接對番茄種子進行種傳病毒的檢測鑒定很少（廖富榮 等，2011），也沒有直接從番茄種子中檢測到TSWV的報道。

本試驗以2018年7月自廣東口岸進境的土耳其番茄種子為試材，采用研磨的種子進行病毒檢測，取樣量較大且樣品均一性高，利用DASELISA方法初篩鑒定，并進一步進行RT-PCR檢測和序列測定，證實該批土耳其進境番茄種子確實攜帶TSWV，實現(xiàn)了TSWV的快速準確鑒定。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

檢測樣品為2018年7月自廣州白云國際機場口岸進境的土耳其番茄種子，編號為1-4436751。

1.2 檢測試劑

用于雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附試驗（DASELISA）多克隆抗體及陽性對照樣品購自美國Agdia公司，檢測的病毒種類包括南芥菜花葉病毒（ArMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）、番茄環(huán)斑病毒（ToRSV）、番茄黑環(huán)病毒（TBRV）。

柱式植物RNA提取試劑盒、RT-PCR兩步法反應(yīng)試劑盒、DNA Marker購自大連TaKaRa生物有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣品制備

稱取0.5 g番茄種子至研磨罐中，在研磨機上研磨1 min，將粉末轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加入3 mL樣品提取緩沖液并混合均勻，然后10 000 r·min-1離心5 min，上清液用于DAS-ELISA檢測。另取100 μL上述樣品提取液，按照試劑盒說明書提取總RNA，用TSWV特異性引物進行擴增，用于RT-PCR檢測。

1.4 DAS-ELISA檢測

根據(jù)Agdia試劑說明書對番茄種子提取液進行DAS-ELISA檢測。每個樣品2次重復(fù)，取平均值。每孔加入檢測樣品提取液100 μL，并在陽性和陰性對照明顯顯色后（約30 min），在酶標儀中讀取吸光值OD405。在滿足質(zhì)量控制要求下，如果樣品OD405/陰性對照OD405≥2，判定為陽性，樣品OD405/陰性對照OD405＜2，判定為陰性。

1.5 RT-PCR檢測

TSWV特異性引物序列和擴增程序參照國家標準 GB/T 31802—2015，引物序列（5′-3′）為：F-AGGATTGGAGCCACTGAC，R-GCTGGAGCT GAGTATAGCAG，擴增序列片段長度為270 bp。檢測時以含TSWV材料的cDNA作為陽性對照，以健康植物材料作為陰性對照，以水代替模板作為空白對照。

cDNA合成：反應(yīng)體系共20 μL，其中模板RNA 3 μL， 反 向 引 物（20 μmol·L-1）1 μL，5×MMLV 酶緩沖液 5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）2 μL，MMLV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶（5 U·μL-1）1 μL，RNAase抑制劑1 μL，補無RNAase水至20 μL。然后37 ℃ 1 h，94 ℃ 10 min，自然冷卻至室溫，-20℃冰箱保存。

PCR擴增體系為25 μL，其中DNA模板2 μL， 上 /下 游 引 物（20 μmol·L-1）0.4 μL，10×PCR 緩 沖 液 2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.5 μL，RNAase抑 制劑1 μL，補雙蒸水至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像儀上觀測和拍照。

1.6 序列測定和分析

PCR產(chǎn)物回收后進行測序（華大基因技術(shù)有限公司）。用Blast進行序列分析，用于比較的GenBank中番茄斑萎病毒序列登錄號為：JX452818、JX452817、KP006412、KP006413、JX452816。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測

DAS-ELISA檢測結(jié)果表明（表1），在檢測樣品中，TSWV檢測項目的OD405/陰性對照OD405＞2，TSWV血清學(xué)檢測結(jié)果呈陽性；其余檢測項目中樣品OD405/陰性對照OD405＜2，檢測結(jié)果呈陰性。根據(jù)DAS-ELISA檢測結(jié)果，初步判斷該批番茄種子中攜帶TSWV。

表1 番茄斑萎病毒DAS-ELISA檢測OD值

2.2 TSWV的RT-PCR檢測與序列測定

2.2.1 RT-PCR檢測 RT-PCR檢測結(jié)果表明，檢測樣品擴增出1條與TSWV陽性對照大小一致的條帶（270 bp左右），而陰性對照及空白對照沒有擴增到該目標條帶（圖1）。因此，該檢測樣品TSWV的RT-PCR特異性檢測結(jié)果呈陽性。

圖1 番茄種子中TSWV特異引物的RT-PCR檢測結(jié)果

2.2.2 序列測定與分析 PCR產(chǎn)物回收純化后進行測序。結(jié)果表明，引物的擴增片段為270 bp，含有上下游引物的相應(yīng)序列，與預(yù)期大小一致。序列Blast比對結(jié)果顯示，與登錄號為KP006413、JX452816的TSWV分離物序列相似度為99%，與登錄號為JX452817、JX452818的TSWV分離物相似度達100%。結(jié)合DAS-ELISA檢測結(jié)果，判斷該批番茄種子中攜帶TSWV。

3 結(jié)論與討論

TSWV寄主范圍廣泛，甚至能侵染一些田間雜草，從而使病源清除困難、傳播速度快、防治困難。TSWV在世界范圍內(nèi)的發(fā)生與西花薊馬、棕櫚薊馬等的廣泛分布和攜帶病毒植物的調(diào)運有關(guān)（侯海霞 等，2015；盧小雨 等，2016）。其中西花薊馬是TSWV最高效的傳播媒介，繁殖速度快、適宜性強、極易產(chǎn)生抗藥性，防治難度較大。進境檢驗檢疫數(shù)據(jù)表明TSWV多次在蓖麻、菜豆、生菜、萵苣、辣椒種子和馬蹄蓮種球、大麗花種球中被口岸截獲。及時在口岸鑒定并銷毀，是重要且有效防控TSWV的手段之一。

本試驗直接采用研磨的種子進行檢測，節(jié)省了種子育苗時間，縮短了檢測周期和口岸貨物通關(guān)周期。大量取樣處理，在保證樣品質(zhì)量的前提下，樣品更具有檢測代表性。同時，由于DAS-ELISA可能會產(chǎn)生假陽性，采用了從血清學(xué)檢測的樣品提取液中提取總RNA進行RT-PCR擴增（廖富榮等，2011），保證了兩種技術(shù)方法采用的為完全一致的樣品，而且兩種檢測方法均為陽性檢出，也與TSWV國家標準的判定一致。這是我國首次在進境番茄種子中截獲TSWV，為進一步加強TSWV的檢疫、防疫工作敲響了警鐘，也對TSWV在種間傳播的研究具有重要推動意義。