楊秀蓮

廣東省惠州市第三人民醫(yī)院婦產科，廣東惠州 516000

稽留流產是妊娠20周內胚胎或胎兒已死亡而未排出母體[1]。發(fā)生原因多種多樣，包括遺傳、感染、環(huán)境、免疫等因素[2-3],但具體機制不詳。一些研究越來越重視感染及細胞凋亡因素，其可能是導致流產發(fā)生的重要因素。多項研究也證實了Toll樣受體4（TLR4）、核轉錄因子-kappaB（NF-κB）與感染及細胞凋亡密切相關。TLR4、NF-κB通過各種機制參與自然流產的發(fā)生及發(fā)展，但兩者與稽留流產的相關研究甚少。本研究采用免疫組化法檢測TLR4、NF-κB稽留流產患者絨毛及蛻膜組織中的表達，探討兩者與稽留流產的關系，為進一步探討稽留流產的發(fā)病機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2017年10月在惠州市第三人民醫(yī)院婦科收治的90例稽留流產患者作為實驗組，其中50例稽留流產伴感染者作為A組，40例稽留流產伴不伴感染者作為B組。A組年齡20～35歲，平均（26.3±2.4）歲；孕齡 7～12 周，平均（9.5±1.5）周；B組年齡 20～36 歲，平均（26.3±2.5）歲；孕齡 7～13 周，平均（9.6±1.5）周。選取同期無合并癥并要求行人工流產的50例早孕婦女作為對照組（C組），年齡23～35歲，平均（27.1±2.5）歲；孕齡 6～10 周，平均（7.5±1.5）周。三組的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。各組夫妻雙方染色體核型正常，男方精液正常，實驗組既往無自然流產、死胎、死產史，無免疫系統異常，無產道異常及遺傳病史，平素月經周期規(guī)律，在流產前無用藥史。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，參與研究者均簽署知情同意書?；袅鳟a診斷標準以人民衛(wèi)生出版社第8版《婦產科學》為主。

1.2 方法

1.2.1 標本來源 所有病例經負壓吸引術后取其絨毛及蛻膜組織，用0.9%生活鹽水沖洗干凈，用4%多聚甲醛固定后送病理科常規(guī)包埋石蠟切片。

1.2.2 免疫組織化學 SP法檢測使用的兔抗人TLR4抗體、鼠抗人NF-κB抗體及通用型免疫組化試劑盒均購于北京中杉生物科技公司。按照試劑說明書進行操作。

1.3 觀察指標與評價標準

1.3.1 HE結果判讀 顯微鏡下觀察絨毛組織無水腫，滋養(yǎng)細胞無明顯增生。

1.3.2 免疫組化染色片的閱讀 以細胞胞膜或胞質中出現棕黃色顆粒，其著色強度高于非特異性背景者為判斷陽性。根據染色深淺及陽性細胞數百分比進行處理。染色深淺評分標準：細胞無顯色或顯色不清為0分，細胞呈淺黃色為1分，細胞呈棕黃色為2分，細胞呈棕褐色為3分；陽性細胞數百分比評分標準：＜10%為 0分，10%～50%為 2分，＞50%～80%為 3分，＞80%為4分。將上述兩項評分相加0～1分定為陰性（-）；2～3 分為陽性（+）；4～5 分為中等陽性（++）；6～7分為強陽性（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析,采用χ2檢驗、Fishem確切概率法檢驗及Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR4、NF-κB在絨毛和蛻膜組織的表達

A、B組及C組的絨毛及蛻膜組織中均可見TLR4、NF-κB表達。其中絨毛組織中TLR4主要表達在細胞滋養(yǎng)細胞及合體滋養(yǎng)細胞細胞的胞質和胞膜中，在蛻膜組織中表達于腺體上皮細胞的胞質和胞膜。NF-κB在絨毛的合體滋養(yǎng)細胞、毛細血管內皮細胞的胞漿中，蛻膜組織主要表達在腺體上皮細胞的胞質中。 A、B組與 C組比較，TLR4、NF-κB在 A、B組的絨毛及蛻膜組織中表達均增高（表1）；與B組比較，TLR4在A組的絨毛及蛻膜組織中表達明顯增高，差異有統計學意義（表2）。

表1 TLR4、NF-κB在三組絨毛組織的表達情況的比較[n（%）]

表2 TLR4在A、B組絨毛組織中表達情況的比較（例）

2.2 相關性分析

經Spearman等級相關分析顯示，A組的TLR4及NF-κB在絨毛及蛻膜組織中表達成正相關（r=0.527，χ2=9.56，P＜0.05）（表3）。

表3 A組的TLR4、NF-κB表達的相關性（例）

3 討論

3.1 TLR4與稽留流產的相關性

TLR4廣泛分布在人體組織中，其與相應的配體結合后，通過各種信號傳導通路激活細胞內級聯反應，促進機體的天然免疫應答以及多種炎性細胞因子的基因表達。低濃度的TNF-α可以維持妊娠正常進行，而高濃度的TNF-α可通過以下機制導致流產發(fā)生：①促進前列腺素E的合成，進而興奮子宮平滑?。虎诖龠M胚胎滋養(yǎng)細胞大量凋亡；③激發(fā)Thl型免疫反應，排斥胚胎組織。TLR4與流產關系密切，張月蓮等[5]研究顯示，復發(fā)性流產的發(fā)生與外周血淋巴細胞、絨毛及蛻膜組織中TLR4高表達密切相關,提示對早孕女性進行外周血TLR4的監(jiān)測,有利于預測流產發(fā)生的風險。Friebe等[6]在研究自然流產模型鼠中發(fā)現,通過加入某些因素使TLR4的異常表達，激活了TLR4信號轉導通路，導致大量炎性因子釋放，使母胎之間產生了較強的免疫排斥反應，最終導致流產的發(fā)生，而阻斷TLR4信號通路，能夠減少胎鼠的丟失，進而減少流產發(fā)生。本研究結果顯示，在稽留流產患者及正常早孕女性的絨毛滋養(yǎng)細胞及蛻膜組織中均有TLR4表達，但TLR4在稽留流產組表達強度明顯高于C組，兩者差異有統計學意義（P<0.05）；且稽留流產患者中伴有炎癥細胞較多的絨毛組織中的TLR4表達強度明顯高于C組，提示TLR4與人類胚胎發(fā)育關系也較為密切；絨毛及蛻膜組織中TLR4的正常表達維持著正常妊娠過程；某些因素導致妊娠女性胚胎中絨毛及蛻膜組織中的TLR4表達增高，而高濃度的TLR4可能通過上述機制使胚胎滋養(yǎng)細胞發(fā)生炎癥反應或細胞凋亡，繼而使胚胎發(fā)育停止，導致稽留流產發(fā)生。

3.2 NF-κB與稽留流產的相關性

NF-κB在機體多種組織細胞中均有表達，其激活后對細胞增殖、氧化應激、細胞凋亡及炎癥反應等過程中發(fā)揮著重要作用。如在感染性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病機制中，NF-κB通過參與調節(jié)炎癥過程中細胞黏附因子和某些細胞因子的表達可能發(fā)揮著重要作用[7]。研究顯示，在妊娠女性子宮內膜及蛻膜組織中均有NF-κB少量表達，低濃度的NF-κB可參與早期胚胎的發(fā)育及著床過程，而NF-κB的表達上調可導致妊娠過程不能繼續(xù)進行。高濃度的NF-κB參與流產發(fā)生的機制如下。①調節(jié)環(huán)氧合酶-2（COX-2）的合成和釋放，后者誘導前列腺素的產生后興奮子宮平滑肌，誘發(fā)子宮收縮；②引起胎盤滋養(yǎng)細胞過度凋亡，加劇母胎之間的排斥反應，間接誘發(fā)子宮收縮；③調節(jié)TNF-α的合成及釋放：高濃度的TNF-α一方面通過提高體內前列腺素E的合成及激活凝血系統，興奮子宮平滑肌，促使胎盤滋養(yǎng)血管內血栓形成，影響絨毛的正常發(fā)育；另一方面激發(fā)Thl型免疫反應，排斥胚胎組織導致流產；④調節(jié)孕酮的表達水平，使孕酮與不能與相應受體結合，不能抑制子宮收縮，繼而不能繼續(xù)維持妊娠[8]。多項研究顯示NF-κB與流產關系密切[9-11]。本研究結果顯示，在稽留流產組及正常早孕組的絨毛合體滋養(yǎng)細胞及蛻膜腺上皮細胞中均有NF-κB表達，但在稽留流產患者絨毛及蛻膜中的表達高于對照組，兩者差異有統計學意義（P<0.05），提示絨毛中正常水平的NF-κB可能參與人類早期胚胎發(fā)育及著床過程，維持正常妊娠過程；某些因素導致絨毛中NF-κB表達增高后可能通過上述機制則使滋養(yǎng)細胞發(fā)生凋亡，繼而胚胎發(fā)育停止，導致稽留流產。

3.3 TLR4-NF-KB信號轉導通路與稽留流產的關系

研究發(fā)現，TLR是體內介導炎癥反應重要的模式識別受體，能夠識別多種病原微生物并啟動下游信號通路，通過活化NF-κB來啟動機體炎癥介質的表達及激活局部組織的炎癥反應[12]，故TLR4-NF-κB是與抗炎免疫機制密切相關的一條信號傳導通路。TLR4信號轉導主要通過MyD88依賴性途徑來介導NF-κB及促炎細胞因子的產生而激發(fā)下游炎癥反應。在細胞內TLR4與配體結合后募集MyD88，使MyD88與特異的接頭蛋白發(fā)生橋接，使TLR4把信號傳到細胞內，通過激活一系列酶促使NF-κB入核后使相關基因發(fā)生轉錄及翻譯，炎性因子大量釋放后參與炎癥反應及組織器官的損傷[13]。多項研究顯示TLR4-NF-κB信號轉導通路在哮喘[14]、心肌梗死[15]、糖尿病[16]、肺炎支原體感染[17]、骨關節(jié)炎[18]、潰瘍性結腸炎[19]等炎癥性疾病中起著重要作用。炎癥因素也是導致流產發(fā)生的原因之一。 白雪等[20]發(fā)現 TLR4、NF-κB、p65 在復發(fā)性流產的絨毛組織中蛋白和mRNA表達水平有升高，推測TLR4-NF-κB信號傳導通路可能與復發(fā)性流產發(fā)生密切相關。本研究顯示，在同一稽留流產患者伴有炎癥的絨毛及蛻膜組織中TLR4與NF-κB表達成正相關，故推測在早期妊娠過程中某些因素如激活了TLR4一NF-κB信號轉導通路，導致體內某些炎性因子大量釋放或細胞異常凋亡，導致稽留流產發(fā)生。