秦 謙 劉 博 楊 琳 吳冰冰 王慧君 董欣然 盧宇藍(lán) 周文浩,2,

拷貝數(shù)變異(CNVs)是一種常見的遺傳多態(tài)性，表現(xiàn)為基因組片段的重復(fù)或缺失。范圍過大的CNVs，如整個染色體水平的變化可導(dǎo)致各類染色體疾病，包括21三體綜合征、Turner綜合征和貓叫綜合征等。影響關(guān)鍵基因的CNVs也可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，如SMN1基因缺失導(dǎo)致的脊髓性肌萎縮癥[1,2]。CNVs的檢測和解讀對臨床上診斷遺傳性疾病非常重要，常規(guī)的CNVs檢測方法包括染色體核型分析、微陣列比較基因組雜交、FISH或熒光定量PCR。這些方法各有特點，考慮到臨床檢測的效率、成本和覆蓋范圍，目前微陣列比較基因組雜交檢測是檢測致病CNVs的主流方法[3, 4]。

高通量測序技術(shù)的發(fā)展帶來了新的CNVs檢測手段[5]。在分析算法上，研究者基于不同的統(tǒng)計模型或不同的標(biāo)準(zhǔn)化方法，開發(fā)了眾多的CNVs檢測算法，如CoNIFER[6]、XHMM[7]和CANOES[8]。在臨床應(yīng)用上，Hehir-Kwa 等[9]在2 603例患者中運用CoNIFER可提升約2%的診斷率。Purcell等[10]運用XHMM算法對ExAC數(shù)據(jù)庫中約60 000例數(shù)據(jù)進(jìn)行了CNVs分析，檢測出一系列的拷貝數(shù)變異譜。如能通過二代測序技術(shù)同時檢測和分析單堿基變異(SNV)和CNVs，對于進(jìn)一步縮短疾病的遺傳檢測時間、提高診斷陽性率都具有重要意義。

然而，目前運用高通量測序技術(shù)流程化地檢測臨床致病變異的方法尚未成熟，其檢測的敏感度和特異度是否等同或優(yōu)于微陣列比較基因組雜交檢測尚無定論。復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院分子診斷中心(我中心)建立了從原始測序數(shù)據(jù)開始的CNVs變異檢測、功能注釋和致病變異排序流程(Pipeline for Clinical NGS-involved CNVs，PICNIC)。本文通過對同時行基因組雜交微陣列比較基因組雜交檢測和高通量測序分析的樣本進(jìn)行對比分析，比較兩種檢測技術(shù)的檢測結(jié)果，探討高通量測序技術(shù)檢測CNVs用于遺傳病臨床診斷的可行性。

1 方法

1.1 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 2016年1月1日至2017年12月31日在我中心基于臨床需要、取得患兒家長知情同意、同時送檢了微陣列比較基因組雜交檢測和高通量測序分析的病例。

1.2 微陣列比較基因組雜交檢測CNVs 采用Agilent Human Genome CGH microarray 180K試劑盒，分辨率為6.4 kb。每次實驗上樣1.5 μg DNA，實驗樣本和標(biāo)準(zhǔn)樣本經(jīng)Agilent DNA Labeling試劑盒進(jìn)行酶切、熒光標(biāo)記、混合、變性、COT-DNA和阻斷試劑處理，在微陣列比較基因組雜交芯片上保溫雜交40 h(65°C，每分鐘20轉(zhuǎn))。芯片清洗后由Agilent G2505A scanner進(jìn)行熒光檢測，圖像由Feature Extraction software識別，經(jīng)Agilent DNA Analytics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和CNVs檢測。

CNVs片段的篩選：①選擇重復(fù)片段>500 kb，缺失片段>200 kb 的CNVs 數(shù)據(jù)；②對照原始圖像，除外假陽性結(jié)果；③除外國際基因組CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(DGV)報道的正常人群的CNVs(片段>80%的重合，且重復(fù)或缺失類型相同)；④除外片段區(qū)域內(nèi)不包含基因的CNVs。然后，結(jié)合患兒表型人工進(jìn)行結(jié)構(gòu)評判。致病/可能致病(P/LP)：檢測到的CNVs已知的表型與患兒表型符合；臨床意義未明(VUS)：檢測到的CNVs已知的表型與患兒表型不完全符合。

1.3 PICNIC

1.3.1 DNA提取及外顯子捕獲測序 采用QIAGEN公司mini blood全血試劑盒抽提血樣基因組DNA。DNA濃度和定量分析采用美國Thermofisher公司生產(chǎn)的NanoDrop紫外分光光度儀測定。全外顯子測序使用SureSelect Human All Exon試劑盒，臨床外顯子組測序使用Agilent ClearSeq Inherited Disease 試劑盒，實驗流程均按說明書進(jìn)行?；蚪MDNA經(jīng)過超聲打斷、末端修復(fù)、接頭連接和雜交捕獲，制成捕獲文庫，使用Illumina HiSeq200平臺測序。測序原始文件經(jīng)Illumina base calling Software 1.7進(jìn)行圖像識別生成序列，處理污染和接頭序列后得到Clean reads，再采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件(v.0.5.9-r16)，以人類基因組hg19(GRCh37)為參考序列進(jìn)行比對得到BAM文件。

1.3.2 流程 圖1顯示，從同一測序批次的BAM文件開始，經(jīng)過外顯子覆蓋深度的計算、質(zhì)控篩選、CANOES計算CNVs評分并提供候選CNVs。再從基因和區(qū)域水平對CNVs進(jìn)行注釋和篩選。

圖1從原始測序數(shù)據(jù)開始的CNVs變異檢測、功能注釋和致病變異排序流程

1.3.2.1 數(shù)據(jù)輸入 輸入數(shù)據(jù)為常規(guī)高通量測序生成的BAM文件，因基線評估需要，一次性需要輸入>20例樣本，盡量保證數(shù)據(jù)來自于同一測序平臺的同一批次。流程另準(zhǔn)備了基于GENCODE注釋(版本v19)的外顯子BED文件，對于不同的捕獲試劑，會另外計算兩者重合的區(qū)域，作為CNVs檢測的靶區(qū)。對于供檢測的BAM文件，使用bedtools multicov軟件計算各樣本在靶區(qū)域上的測序片段豐度(reads coverage)，并將此豐度數(shù)據(jù)用作CNVs變異檢測。

1.3.2.2 變異檢測 采用CANOES算法[8]進(jìn)行CNVs變異的檢測。該算法基于負(fù)二項分布建立測序片段豐度和拷貝數(shù)變異的關(guān)聯(lián)模型，并用每個外顯子的QC含量進(jìn)行校正。原始的CANOES算法不包括對X染色體的檢測，流程通過對男性樣本的X染色體數(shù)據(jù)加倍處理、重新評估基線，實現(xiàn)了對X染色體上CNVs的檢測。

1.3.2.3 變異注釋 在基因水平上，首先整合了RefSeq定位、相關(guān)OMIM致病基因注釋、HGMD致病基因注釋和SwissProt基因功能注釋，總結(jié)CNVs所影響到的基因可能導(dǎo)致的癥狀或表型；然后，參考內(nèi)部CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫的頻率，對檢出CNVs的頻率>10%的基因進(jìn)行標(biāo)記并過濾；最后，通過與樣本的標(biāo)準(zhǔn)人類表型術(shù)語(HPO)進(jìn)行自動化匹配，對影響基因功能、相關(guān)表型符合疾病既往文獻(xiàn)報道的CNVs進(jìn)行標(biāo)注。在區(qū)域水平上，結(jié)合DGV、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫對CNVs進(jìn)行區(qū)域重合對比，標(biāo)記出公共數(shù)據(jù)庫所報道的CNVs突變；同時參考前期研究中總結(jié)的致病CNVs核心基因[11]，對已知的可能通過拷貝數(shù)變異形式致病的基因進(jìn)行標(biāo)記；最后，評估所檢出CNVs的大小，對于>1 Mb的變異予以標(biāo)注。

1.3.2.4 變異優(yōu)選 在基因水平上，綜合考慮CNVs所影響基因的遺傳模式、既往報道的基因相關(guān)的疾病表型和患者的匹配程度、基因上CNVs變異的人群頻率，進(jìn)一步對樣本中檢出的CNVs進(jìn)行優(yōu)選；對覆蓋核心基因、既往文獻(xiàn)報道的致病CNVs或>1 Mb的CNVs進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果以P/LP或VUS輸出。

1.4 預(yù)設(shè)結(jié)果判讀和統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果的判讀：①針對P/LP及VUS的CNVs，②針對經(jīng)過篩選步驟后的全部檢測出的CNVs。比較兩種方法的檢出率。針對敏感度和陽性檢出率，通過比率檢驗給出95%CI。

2 結(jié)果

2.1 一般信息 113例病例進(jìn)入本文分析，男性68例。年齡生后1 d至11歲，均值2歲，中位數(shù)1歲。臨床表型包括發(fā)育遲緩82例，驚厥16例，孤獨癥5例，先天性心臟病3例，遺傳咨詢7例。

2.2 微陣列比較基因組雜交檢測CNVs結(jié)果 通過CNVs篩選流程，由臨床醫(yī)生審核數(shù)據(jù)后得出報告結(jié)論。檢測到CNVs共446個，每例樣本平均3.9個。

2.3 PICNIC分析結(jié)果 113例樣本的NGS數(shù)據(jù)，49例全外顯子測序和64例臨床外顯子測序的病例，平均測序深度分別為125X和183X，分別有靶向的95%和97%的外顯子獲得了≥20X的覆蓋倍數(shù)，分別有87%和90%的外顯子覆蓋倍數(shù)方差/均值比<0.3。對外顯子捕獲測序的質(zhì)控結(jié)果表明，113例的數(shù)據(jù)具有足夠高的覆蓋深度，且樣本之間的實驗誤差較小，可以用于基于外顯子測序深度的CNVs分析。具體到檢測的應(yīng)用，在所有GENCODE的外顯子注釋基礎(chǔ)上，只保留了在所有檢測樣本中都覆蓋>5次的外顯子區(qū)域。流程共檢測到CNVs 236個，每例樣本平均2.1個。

2.4 微陣列比較基因組雜交和PICNIC檢測CNVs結(jié)果比較

2.4.1 P/LP及VUS的CNVs 微陣列比較基因組雜交檢測到P/LP為76例，VUS為37例；PICNIC檢測到P/LP為92例，VUS為21例；微陣列比較基因組雜交檢測到的P/LP和VUS病例均包含在PICNIC檢測到的病例中，微陣列比較基因組雜交檢測為VUS的37例CNVs被PICNIC納入P/LP。微陣列比較基因組雜交檢測CNVs的VUS被PICNIC升級的原因主要為區(qū)域內(nèi)基于基因的表型注釋與患者臨床表現(xiàn)出現(xiàn)部分匹配，故而被納入P/LP。以微陣列比較基因組雜交檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，以PICNIC為待測標(biāo)準(zhǔn)，敏感度100%(95%CI: 94%～100%)，特異度100%(95%CI: 81%～100%)，陽性預(yù)測值82.6%(95%CI: 73%～89)，陰性預(yù)測值56.8%(95%CI:40%～72%)。

2.4.2 針對經(jīng)過自動篩選后的全部CNVs 微陣列比較基因組雜交檢測到的446個CNVs中，PICNIC檢測到190個；PICNIC檢測到的236個CNVs中，微陣列比較基因組雜交檢測到190個。對于PICNIC檢測到而微陣列比較基因組雜交未檢測到的CNVs，包含30例缺失和16例重復(fù)。其中1例5號染色體長臂1.5 Mb嵌合重復(fù)的log2ratio為0.331，其余重復(fù)的log2ratio為1.30～1.97(均值0.596)，缺失的log2ratio為-NA～-0.680(均值-4.12，-NA表示測序深度為0)。經(jīng)比對PICNIC檢測到的測序深度為0的DEL，多為本研究所用微陣列比較基因組雜交探針未覆蓋區(qū)域；1例嵌合重復(fù)，在下調(diào)微陣列比較基因組雜交檢測分析軟件閾值之后能夠檢出。

2.5 成本效益對比 目前我院微陣列比較基因組雜交檢測的臨床價格為每例2 000～5 000元人民幣，本文中參與對比的微陣列比較基因組雜交檢測樣本為中等程度的分辨率水平(探針密度為180 k)，臨床成本4 800元，臨床檢測周期3～4周。相對于高通量捕獲測序，臨床外顯子組測序的價格目前為每例1 800元，臨床檢測周期2～3周。兩者臨床檢測周期相差不多，但微陣列比較基因組雜交檢測較PICNIC每例多花費3 000元左右。

3 討論

3.1 PICNIC分析流程 基于捕獲的高通量測序技術(shù)常用于大規(guī)模檢測SNV或小片段插入/缺失突變，是目前遺傳病診斷和研究的主要方法之一。隨著近年來算法方面的研究進(jìn)展，通過高通量捕獲測序檢測CNVs成為可能?？紤]到臨床檢測對于變異檢測、注釋、篩選的綜合需求，我中心整合現(xiàn)有的CNVs檢測算法，建立了可用于優(yōu)選臨床陽性CNVs結(jié)果的PICNIC分析流程，能夠從原始的高通量測序數(shù)據(jù)出發(fā)，結(jié)合數(shù)據(jù)輸入處理、變異檢測、變異注釋和變異優(yōu)選為一體，便于臨床報告使用。PICNIC分析流程在本研究測試樣本中平均檢測到CNVs 2.1個，相比微陣列比較基因組雜交檢測(3.9個)，大幅縮小了后續(xù)進(jìn)入人工分析的CNVs數(shù)量，提升了診斷效率?？紤]到VUS在長期隨訪或科學(xué)研究中也很重要，在特殊情況下也可直接分析原始的檢測結(jié)果。

3.2 CNVs檢測結(jié)果對比 微陣列比較基因組雜交檢測CNVs的不足：探針設(shè)計并非全基因組覆蓋，部分基因遺漏；對于較小的CNVs，由于微陣列比較基因組雜交無法獲得足夠的探針統(tǒng)計數(shù)而無法檢測。高通量測序提供了以外顯子為檢測單位的CNVs信息，檢測范圍更精細(xì)。在CNVs檢測的具體斷裂位點和大小方面，微陣列比較基因組雜交檢測在探針設(shè)計階段，通過控制探針的密度實現(xiàn)對CNVs真實斷點和大小的判斷。基于高通量捕獲測序的CNVs檢測，受限于外顯子分布，只能從外顯子角度對CNVs的大小和影響范圍進(jìn)行推測。鑒于目前對CNVs致病性的解讀主要以致病基因為主，基于外顯子測序的CNVs檢測能夠滿足對有臨床意義的變異的檢測需求。對于檢測非編碼區(qū)域CNVs或是明確斷點位置，外顯子捕獲測序并不適用，可以考慮通過全基因組測序進(jìn)行更精確的檢測和分析。由于實驗隨機誤差的影響，外顯子捕獲測序檢測CNVs需要穩(wěn)定的實驗流程和大量樣本的積累來保證準(zhǔn)確性。

本文以113例同時行高通量測序和微陣列比較基因組雜交檢測的樣本為例，比較了兩種檢測方式在數(shù)據(jù)處理和報告結(jié)果方面的區(qū)別。對于微陣列比較基因組雜交檢測的76例P/LP，PICNIC流程均能夠精確檢測到，實現(xiàn)了100%的覆蓋率；對于微陣列比較基因組雜交檢測到的37例VUS，PICNIC分析流程將其中16例定義為P/LP，主要原因為區(qū)域內(nèi)基于基因的表型注釋與患者臨床表現(xiàn)存在部分匹配，故而被升級為P/LP。其中的表型主要為一些非特征性、不具備診斷意義的表型，如肌張力低下、發(fā)育落后、智力低下等。故對于VUS的變異還需要予以關(guān)注。

從CNVs的全部情況看，微陣列比較基因組雜交檢測到的446個CNVs中，PICNIC檢測到42.6%(190/446)。這些CNVs中部分被PICNIC檢測到，但是過濾掉了，主要原因是區(qū)域內(nèi)包含的基因與患者臨床表現(xiàn)完全不匹配。還有部分PICNIC并未檢測到。因此，CNVs最為可靠的方式還是微陣列比較基因組雜交檢測，也客觀說明，基于高通量測序數(shù)據(jù)的CNVs識別在技術(shù)層面還有上升的空間。在PICNIC檢測到的236個CNVs中，微陣列比較基因組雜交也檢測到190個CNVs。這些CNVs大部分并沒有被微陣列比較基因組雜交檢測到，主要原因是CNVs較小，僅累及單個或幾個基因。提示微陣列比較基因組雜交檢測對于CNVs的分析也有一定局限性。

3.3 成本效益對比 雖然兩種方法臨床檢測周期相近，但微陣列比較基因組雜交較PICNIC每例多花費約3 000元。除CNVs檢測外，高通量捕獲測序還能提供關(guān)鍵的SNV及Indel信息，這是微陣列比較基因組雜交檢測無法獲取的。因此，綜合考慮遺傳病的臨床診斷，高通量測序能一次性獲取CNVs和SNV的信息，改進(jìn)整體的診斷效率和時間成本。未來如能進(jìn)一步提高檢測的精準(zhǔn)性，將在臨床基因檢測中發(fā)揮更大作用。