李靜 王智存 白廣紅 鄒遠(yuǎn)嫵 梁亞萍 王卓

我國是全球22個(gè)結(jié)核病(Tuberculosis, TB)高負(fù)擔(dān)國家之一，尤其是我國中西部省、自治區(qū)，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的高負(fù)擔(dān)國家之一[1-2]。TB是一種長期嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，在全球廣泛流行，并且已經(jīng)成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題和經(jīng)濟(jì)問題[3-4]。世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年的調(diào)查報(bào)告顯示，全球新感染TB有一半以上(60%)分布在印度、中國、尼日利亞、巴基斯坦和南非[5-6]。1992年首次出現(xiàn)了MDR-TB，2006年WHO提出了廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的概念，由于MDR-TB的逐年增加，從而增大了TB的治愈難度[7]。

結(jié)核分枝桿菌(MycobacrteriumTuberculosis, MTB)是引起TB的病原菌，耐藥患者的產(chǎn)生也成為TB流行的一個(gè)因素，因此建立快速敏感的MTB藥敏測定方法是有效控制TB的關(guān)鍵[8]。WHO把羅氏藥敏測定法作為MTB藥敏檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而我國目前檢測分枝桿菌藥敏測定方法主要是羅氏藥敏檢測，但是其檢測時(shí)間長，需要4～6周才能得到藥敏測定結(jié)果，限制了臨床及時(shí)對患者進(jìn)行診斷與治療[9-12]。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷提升，目前已經(jīng)有比較多的分子生物學(xué)診斷的新方法。但就目前而言，基因型相關(guān)的分子生物學(xué)耐藥檢測方法雖然提升了診斷檢驗(yàn)的時(shí)間，但對于各類抗結(jié)核藥物，其耐藥突變位點(diǎn)的研究尚不全面，比較局限于常規(guī)的一線藥以及少數(shù)的二線藥。因此，耐藥表型的研究方法仍然十分重要[13-16]。

近年來，WHO已提倡采用液體型培養(yǎng)基對分枝桿菌進(jìn)行培養(yǎng)及藥敏測定，因此，液體培養(yǎng)的藥敏檢測方法備受結(jié)核界醫(yī)者的關(guān)注[17]。本研究旨在探討結(jié)核分枝桿菌MicroDSTTM微孔板藥敏測定法對一、二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)的效果，并與傳統(tǒng)的羅氏比例法進(jìn)行比較，同時(shí)也與BACTEC-MGIT 960系統(tǒng)對一線藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，進(jìn)而探討其在一、二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 臨床標(biāo)本： 收集陜西省結(jié)核病防治院2017年1月至2017年7月住院和門診確診為結(jié)核患者的痰、胃灌洗液并經(jīng)BACTEC-MGIT 960培養(yǎng)陽性5～7 d的新鮮培養(yǎng)物，且鑒定為結(jié)核分支桿菌感染的201例患者，其中男性141例，女性60例。

2. 試劑與儀器： BACTEC-MGIT 960檢測所用的配套試劑，由美國BD公司提供。MicroDSTTM微孔板藥敏檢測試劑盒(培養(yǎng)法)由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供。BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀購自美國BD公司；多通道渦旋振蕩器、自動(dòng)加樣機(jī)、YK-909分枝桿菌藥敏閱讀儀均由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供。

采用一、二線抗結(jié)核藥物，包括鏈霉素(streptomycin, SM)、異煙肼(isoniazid, INH)、利福平(rifampicin, RFP)、乙胺丁醇(ethambutol, EMB)、阿米卡星(amikacin, AM)、卷曲霉素(capreomycin, CM)、左氧氟沙星(levofloxacin, LFX)、莫西沙星(moxifloxacin, MFX)、對氨基水楊酸(para-amino-salicylate, PAS)、丙硫異煙胺(protionamide, PTO)進(jìn)行藥物敏感性檢測。

二、試驗(yàn)方法

1. MicroDSTTM微孔板藥敏檢測： 將無菌稀釋液全部加入凍干雜菌抑制劑中，充分搖勻，吸取100 μl加入藥敏培養(yǎng)基，并充分混合均勻。分別吸取180 μl藥敏培養(yǎng)基加入A1/E1和B1/F1孔中，其中A1/E1孔作為1/10參照孔和B1/F1孔作為1/100參照孔，再吸取200 μl藥敏培養(yǎng)基加入到C1、D1孔或G1、H1孔作為陰性對照。將MTB臨床分離菌株置于離心管中，以離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心3～5 min，取適量離心沉淀菌株加入到磨菌管里，將其放到Y(jié)K-50多通道快速混勻器上，轉(zhuǎn)速2 500 r/min，磨菌30～45 s后靜置10～15 min，取上層均勻菌懸液用無菌生理鹽水比濁至1 mg/ml，最后吸取100 μl配置好的菌懸液至藥敏培養(yǎng)基中，混勻。在96孔板中每孔加200 μl含菌的藥敏培養(yǎng)基(除上述4個(gè)陰性對照孔)，再吸20 μl到A1/E1孔作為1/10參照孔，最后從A1/E1孔吸20 μl至B1/F1作為1/100參照孔。蓋上盒蓋密封后置37 ℃培養(yǎng)7～14 d觀察結(jié)果，生長結(jié)果由肉眼觀察或通過YK-909閱讀，報(bào)告按照防癆規(guī)程執(zhí)行。

2. 羅氏比例法藥敏檢測： 按照中國防癆協(xié)會(huì)制訂的操作規(guī)程進(jìn)行羅氏比例法藥敏檢測。取前期處理過的標(biāo)本液，將1 mg/ml的菌懸液稀釋至10-2mg/ml、10-4mg/ml，分別取0.01 ml接種含藥培養(yǎng)基盒對照培養(yǎng)基斜面上，使每管終接種菌量為10-4mg/ml、10-6mg/ml。置于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果，藥敏結(jié)果的觀察及報(bào)告按照防癆規(guī)程執(zhí)行。

耐藥百分比的計(jì)算：

注：耐藥百分比大于或等于1%，則認(rèn)為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥；耐藥百分比小于1%，則認(rèn)為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥。

結(jié) 果

一、羅氏檢測法及BACTEC-MGIT 960檢測法檢測抗結(jié)核藥藥敏檢測結(jié)果

通過羅氏比例法檢測201株MTB臨床分離株對10種一、二線抗結(jié)核藥物的藥敏檢測結(jié)果，見表1；采用BACTEC-MGIT 960法檢測四種一線抗結(jié)核藥物的藥敏檢測結(jié)果，見表2。

表2 BACTEC-MGIT 960檢測一線抗結(jié)核藥的藥敏檢測結(jié)果

注：SM：鏈霉素；INH：異煙肼；RFP：利福平；EMB：乙胺丁醇；LFX：左氧氟沙星；MFX：莫西沙星；PAS：對氨基水楊酸；PTO：丙硫異煙胺；CPM：卷曲霉素；AK：丁胺卡那霉素

二、MicroDSTTM微孔板結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測結(jié)果

201株MTB臨床分離菌株通過MicroDSTTM微孔板藥敏檢測結(jié)果，見表3。

三、BACTEC-MGIT 960藥敏結(jié)果與羅氏比例法藥敏結(jié)果對比

以羅氏比例法藥物敏感性作為標(biāo)準(zhǔn)，則BACTEC-MGIT 960法藥物敏感性、特異性及符合率，見表4。

表4 BACTEC-MGIT 960藥敏結(jié)果和羅氏比例法的藥敏結(jié)果對比

注：R表示耐藥；S表示敏感；SM：鏈霉素；INH：異煙肼；RFP：利福平；EMB：乙胺丁醇；LFX：左氧氟沙星；MFX：莫西沙星；PAS：對氨基水楊酸；PTO：丙硫異煙胺；CPM：卷曲霉素；AK：丁胺卡那霉素

四、MicroDSTTM微孔板藥敏結(jié)果與羅氏比例法藥敏結(jié)果對比。

以羅氏比例法藥物敏感性作為標(biāo)準(zhǔn)，則MicroDSTTM法藥物敏感性、特異性及符合率，見表5。

討 論

近年來，全球耐藥結(jié)核病的發(fā)病率呈上升趨勢，隨著耐藥結(jié)核病的增多，耐藥性已成為TB控制的三大難題之一。目前國內(nèi)臨床上采用的分枝桿菌藥物敏感性測定方法主要是羅氏絕對濃度法和比例法藥敏，但是其藥敏檢測時(shí)間長需要4周方可獲得藥敏檢測結(jié)果。長周期的檢測時(shí)間對治療TB很難起到輔助作用，特別是治療耐藥結(jié)核病的藥物主要是二線抗結(jié)核藥物，而目前常使用的二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)方法還是以羅氏比例法為主要的診斷方法，該法耗時(shí)長，基本上很難滿足臨床的診斷需求。因此，亟需研究出快速、可靠又準(zhǔn)確的藥敏檢測技術(shù)來指導(dǎo)臨床的合理用藥。

表1 結(jié)核分枝桿菌羅氏比例法藥敏檢測結(jié)果

注：SM：鏈霉素；INH：異煙肼；RFP：利福平；EMB：乙胺丁醇

表3 MicroDSTTM微孔板檢測一線、二線抗結(jié)核藥的藥敏檢測結(jié)果

注：SM：鏈霉素；INH：異煙肼；RFP：利福平；EMB：乙胺丁醇；AK：丁胺卡那霉素；CPM：卷曲霉素；LFX：左氧氟沙星；MFX：莫西沙星；PAS：對氨基水楊酸；PTO：丙硫異煙胺

表5 MicroDSTTM微孔板藥敏與羅氏比例法藥敏結(jié)果對比

注：R表示耐藥，S表示敏感

世界衛(wèi)生組織一直提倡使用液體培養(yǎng)基藥敏檢測方法進(jìn)行抗結(jié)核藥物的藥敏檢測，但是目前臨床上可以使用的基于液體的藥敏測定技術(shù)，需要昂貴的儀器設(shè)備，且檢測成本較高，限制了其推廣應(yīng)用[18-21]。MicroDSTTM微孔板藥敏檢測試劑盒(培養(yǎng)法)是十一五重大專項(xiàng)科研轉(zhuǎn)化成果的新型快速藥敏檢測方法，具有快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、操作簡單的優(yōu)勢[22]。目前國內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開始考慮進(jìn)行使用MicroDSTTM微孔板藥敏檢測試劑盒(培養(yǎng)法)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)，因?yàn)樵擁?xiàng)技術(shù)目前可以同時(shí)檢測多達(dá)16種抗結(jié)核藥物，具備4個(gè)一線藥物以及12個(gè)二線藥，7～14 d即可出檢測報(bào)告，能為臨床應(yīng)用提供快速的藥敏結(jié)果以及多種藥物敏感的信息，這有利于患者的早期診斷和治療。

一、以改良羅氏比例法為參考標(biāo)準(zhǔn)評估MicroDSTTM微孔板藥敏檢測試劑盒檢驗(yàn)的敏感度、特異度以及抑制率分析

本文應(yīng)用MicroDSTTM微孔板藥敏檢測試劑盒對陜西省結(jié)核病防治院的201株MTB臨床分離菌株對SM、INH、RFP、EMB、AM、CM、LFX、MFX、PAS和PTO10種藥物的藥物敏感性檢測進(jìn)行了重點(diǎn)研究。結(jié)果顯示，除了SM、INH和RFP的耐藥率分別為24.9%、29.4%和15.4%之外，其他藥物的耐藥率都低于10%。MicroDSTTM法獲得藥敏報(bào)告的最短時(shí)間為5 d，最長為14 d，平均報(bào)告時(shí)間為10 d，比羅氏比例法藥物敏感性的報(bào)告時(shí)間30 d縮短了20 d，且其特異性和符合率均達(dá)95%以上，而藥物敏感性除了CM和LFX分別為85.7%和84.6%之外，其他藥物的藥敏均達(dá)92%以上出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是試驗(yàn)所用的藥物濃度和純度的差異所致[20]。其中PTO的敏感度以及特異度都是100%，其主要原因是羅氏比例法檢測結(jié)果為耐藥菌株僅為2株，其結(jié)果都檢測出其耐藥性，但是由于耐藥菌株的數(shù)量過于少量，可能其檢出率不具備代表性。但總體上說明MicroDSTTM法與傳統(tǒng)的羅氏比例法具有較高的一致性。

二、比較兩種表型藥敏結(jié)果的分析對比

BACTEC-MGIT 960法的藥敏檢測結(jié)果與羅氏比例法藥敏檢測結(jié)果對比的特異性與符合率達(dá)97%以上，藥物敏感性也達(dá)94%以上，測時(shí)間平均為8.1 d，比羅氏快將近20 d的時(shí)間，這和已發(fā)表的文獻(xiàn)中提到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)相當(dāng)[23-29]。BACTEC-MGIT 960法的藥敏檢測一線藥結(jié)果與羅氏比例法藥敏檢測結(jié)果的對比結(jié)果比MicroDSTTM法藥敏檢測一線藥與傳統(tǒng)的羅氏比例法對比的結(jié)果的藥物敏感性、特異性及符合率都高，而且兩者之間的相差不大，表現(xiàn)有比較好的一致性，可見MicroDSTTM的技術(shù)已接近BACTEC-MGIT 960法的技術(shù)。但是MicroDSTTM微孔板藥敏檢測不需依托于昂貴的設(shè)備，僅僅使用肉眼都可以直接觀察結(jié)果，就獲得其詳細(xì)的藥敏結(jié)果數(shù)據(jù)，而且MicroDSTTM微孔板藥敏檢測在培養(yǎng)操作上也是非常簡單快捷，一次性可同時(shí)完成一線、二線的檢測，其費(fèi)用也是相當(dāng)?shù)土?/p>

三、不足之處以及應(yīng)用前景分析

本文還存在一些不足之處，對于數(shù)字表法隨機(jī)選擇的耐藥菌株，由于研究的時(shí)間局限性，導(dǎo)致了對部分抗結(jié)核藥物的耐藥菌株的樣本比較少，對結(jié)果的評判具有一定的影響。本次針對MicroDSTTM微孔板藥敏檢測試劑盒(培養(yǎng)法)的臨床應(yīng)用進(jìn)行研究對比，其可以同時(shí)一次性檢測高達(dá)16個(gè)抗結(jié)核藥物，本次重點(diǎn)研究4個(gè)一線藥以及6個(gè)二線藥 ，對其他的6個(gè)二線沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，是由于樣本的數(shù)量問題，其他一些二線藥不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。其次本文都是通過表型藥敏感藥敏實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行對比的，對于一些不符合的耐藥標(biāo)本，未進(jìn)一步進(jìn)行基因測序分析，可能在進(jìn)行基因測序確認(rèn)的情況下，能更為準(zhǔn)確的對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，但是主要考慮到樣本過小，基因測序也很難準(zhǔn)確說明測序的結(jié)果更支持哪一種實(shí)驗(yàn)方法，所以進(jìn)行了表型藥敏實(shí)驗(yàn)的對比分析[30-32]。

MicroDSTTM微孔板主要優(yōu)勢在于可以同時(shí)檢測對結(jié)核分枝桿菌一線、二線藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)，這可以方便臨床制定個(gè)性化治療方案，而且MicroDSTTM法與傳統(tǒng)羅氏比例法的藥敏檢測費(fèi)用相當(dāng)，明顯比BACTEC-MGIT 960法檢測費(fèi)用低很多，而且配套的儀器價(jià)格便宜，操作簡單、快速。另外，MicroDSTTM微孔板法還可以和快速分子檢測相結(jié)合，可以及時(shí)的為耐多藥患者進(jìn)行一線、二線藥物的表型實(shí)驗(yàn)，對于結(jié)核病耐多藥的檢測和治療也有比較大的臨床價(jià)值和意義。

綜上所述，利用MicroDSTTM微孔板藥敏檢測試劑盒該檢測方法既同時(shí)可以獲得較為詳細(xì)和多種藥物的菌株耐藥數(shù)據(jù)，又可以提供簡明的藥敏值的判斷，可以滿足臨床的多種需求，該方法在7～10 d可以獲得結(jié)果，且不需要昂貴的設(shè)備，僅用肉眼也可以判讀其結(jié)果，且符合率以及特異性是都是比較好的，具有較好的臨床價(jià)值。