周柯均 王 城 謝夢憶 張 燦 楊金鳳 楊遠(yuǎn)波 蒲 娟

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，約占人類腫瘤的6%，其發(fā)病率高，惡性程度高，浸潤和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，病死率僅次于胃癌和食道癌，嚴(yán)重威脅人們的生命健康和生活質(zhì)量[1-2]。因其早期臨床癥狀不明顯，當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀時多數(shù)已達(dá)中晚期，且肝癌術(shù)后易復(fù)發(fā)，化療后易產(chǎn)生耐藥性，因此研究肝癌的發(fā)生機(jī)制并尋找有效的治療手段迫在眉睫[3]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是極其復(fù)雜的過程，多種分子信號通路參與了腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。氯喹是一種治療瘧疾和類風(fēng)濕的藥物，同時也是一種常用的自噬抑制劑，可通過選擇性抑制細(xì)胞酸性溶酶體的降解而抑制自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4-5]。本研究通過建立HepG2小鼠肝癌腫瘤模型，探討氯喹對肝癌小鼠腫瘤增殖的影響及其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級實(shí)驗(yàn)用健康小鼠75只(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，小鼠編號20171205)，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，平均體質(zhì)量(20.8±1.5)g。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級屏障系統(tǒng)內(nèi)。飼養(yǎng)條件：溫度22～26℃，相對濕度40%～60%，所用飼料、飲用水和墊料等均經(jīng)嚴(yán)格消毒滅菌并定期進(jìn)行更換。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院(上海)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含1%青霉素和鏈霉素)，37℃，5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)并傳代。待細(xì)胞增長至1×107個時終止，PBS潤洗，胰酶消化，經(jīng)臺盼藍(lán)染色并顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞>90%，收集至1.5 mL EP管中。

1.3 HepG2肝癌移植瘤的建立與分組 將收集的HepG2肝癌細(xì)胞株(2×107/mL)直接腹腔接種到5只小鼠體內(nèi)，7 d后小鼠腹腔產(chǎn)生大量腹水，在無菌條件下抽取3 mL小鼠腹水作為腫瘤源，并加入15 mL生理鹽水進(jìn)行稀釋，將腫瘤細(xì)胞調(diào)整至2.0×108/mL，分別取0.3 mL細(xì)胞懸液接種于75只小鼠右前肢腋部皮下，1～2 d后小鼠皮下即可長出瘤塊。將75只小鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量氯喹處理組和高劑量氯喹處理組，每組各25只。氯喹處理組小鼠分別于建模后第2天開始腹腔注射氯喹(25 μmol/L和50 μmol/L)，對照組則注射生理鹽水作為對照，連續(xù)處理16 d并密切觀察小鼠存活狀態(tài)。16 d后所有小鼠腹腔注射0.8%戊巴比妥(60 mg/kg)，待小鼠失去意識后處死，收集腫瘤標(biāo)本并備用。

1.4 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 分別取3組小鼠腫瘤組織100 mg，加入300 μL組織裂解液充分裂解40 min后，14 000 r/min離心10 min，取上清液加入5倍對比液并于沸水中煮15 min，電泳及轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用1∶1 000體積比稀釋的LC3及P62抗體(美國abcam公司，編號ab37215和ab86225)4℃孵育過夜，次日PBS洗膜3次，然后用1∶5 000體積比稀釋的羊抗兔二抗室溫孵育2 h后PBS洗膜3次，顯影液顯影；蛋白表達(dá)定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進(jìn)行分析，內(nèi)參采用β-actin。

1.5 免疫組化檢測自噬發(fā)生情況 石蠟組織標(biāo)本包埋后連續(xù)切片，固定于載玻片上，50℃烘箱中烘1 h后，二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及75%乙醇依次進(jìn)行水化，蒸餾水洗滌3次，然后置于檸檬酸鈉溶液中加熱2次，每次8 min，PBS洗滌3次，3% H2O2溶液中浸10 min，PBS洗滌3次后，滴加LC3和P62抗體稀釋液，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次后用羊抗兔二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，免疫組化染色，蘇木精復(fù)染，0.1% HCl分化，藍(lán)化，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組化結(jié)果評估由專業(yè)病理人員進(jìn)行判定，每張組織切片隨機(jī)選取8個視野，根據(jù)著色程度進(jìn)行打分。其中著色程度：與背景一致為0分、淺黃色1分、棕黃色2分、深褐色3分；蛋白表達(dá)定量分析用Image J圖像分析軟件對免疫組化反應(yīng)物的顏色區(qū)域與對照組進(jìn)行平均光密度或者積分光密度分析。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞活力 為檢測不同濃度氯喹對細(xì)胞活力的影響，將生長至對數(shù)期的HepG2肝癌細(xì)胞以5×104/mL的濃度接種于96孔板，每孔0.2 mL，對照組、氯喹處理組各3孔，并設(shè)置3組重復(fù)。待24 h細(xì)胞貼壁后，向氯喹低劑量和高劑量處理組中分別加入含25 μmol/L和50 μmol/L氯喹的DMEM培養(yǎng)基，對照組則加入等體積的PBS緩沖液，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h。然后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻，用酶標(biāo)儀檢測各孔細(xì)胞在570 nm波長處的OD值，計算細(xì)胞存活率并繪制相應(yīng)的濃度-存活曲線。

2 結(jié)果

2.1 造模基本情況比較 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示造模第5天開始進(jìn)入腫瘤初期，小鼠腋下可見瘤體形成，隨后繼續(xù)增大，約第10天可見腫瘤突起，小鼠精神萎靡，活動量顯著下降，且覓食減少。小鼠表面特征無明顯差異，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)無小鼠死亡。小鼠的體質(zhì)量、出瘤時間以及造模成功率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模成功后分為對照組、低劑量氯喹組和高劑量氯喹組。詳見表1。

表1 裸小鼠造模后基本情況比較

2.2 Western blot檢測氯喹對肝癌組織自噬水平的影響 對照組小鼠肝癌組織中LC3-Ⅱ蛋白(1.26±0.21)%和 P62(3.62±0.32)%的相對表達(dá)水平較低，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值也較低。與對照組相比，氯喹處理組小鼠肝癌組織中LC3-Ⅱ(3.15±0.29)%[q=37.325,P<0.001]和P62(6.24±0.41)%[q=35.621,P<0.001]的蛋白水平均提高，3組間比較差異統(tǒng)計學(xué)分析有意義(F=696.587，P<0.001，F(xiàn)=537.265，P<0.001)；LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值也增加[(3.53±0.61) 比(1.62±0.43)，q=18.631，P<0.001)]，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=163.739，P<0.001)；且高劑量氯喹處理組小鼠肝癌組織中LC3-Ⅱ(10.05±0.83)%和P62(15.16±0.73)%蛋白的增加幅度高于氯喹低劑量處理組[LC3-Ⅱ(6.26±0.49)%(q=27.805，P<0.001)和P62(9.78±0.45)%(q=44.361，P<0.001)]。詳見圖1。

2.3 免疫組化檢測氯喹對小鼠肝癌組織自噬水平的影響 對照組小鼠肝癌組織中LC3(5.62±0.43)%和P62(6.32±0.51)%的表達(dá)水平均處于較低水平，細(xì)胞陽性率低，染色強(qiáng)度較弱，而氯喹處理組小鼠肝癌組織中的LC3和P62表達(dá)水平均上升[LC3(10.33±0.75)%(q=82.181，P<0.001)和P62(11.08±0.59)%(q=91.920，P<0.001)]，并且隨著氯喹處理濃度的增加，組織染色更深，細(xì)胞陽性率更高[LC3(17.60±0.92)%(q=49.871，P<0.001)和P62(19.71±0.23)%，t=13.08，P=0.029(q=50.700，P<0.001)]，3組間的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=144.712，P<0.001；F=226.641，P<0.001)]。詳見圖2。

2.4 MTT比色法檢測氯喹對HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制率 與對照組相比，不同劑量的氯喹相同時間處理組細(xì)胞的增殖率均下降(162.26±18.62)%(q=12.937，P=0.021)和(162.38±18.75)%(q=15.397，P=0.016)；3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.566，P<0.001)。隨著氯喹作用時間的增加，低劑量氯喹處理組細(xì)胞增值率均下降(112.54±16.87)%(q=13.875，P=0.017)；高劑量氯喹處理組細(xì)胞的增殖率均下降(109.24±15.98)%(q=14.586，P=0.013)，不同時間點(diǎn)的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=138.271，P<0.001；F=79.652，P<0.001)詳見圖3。

圖3 MTT法檢測氯喹對HepG2細(xì)胞的增殖抑制率

3 討論

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的膜結(jié)構(gòu)包裹胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自吞噬體，后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并降解其內(nèi)的內(nèi)容物，以維持細(xì)胞自身的生長代謝和細(xì)胞成分的更新，參與細(xì)胞分化，生長調(diào)控，組織修復(fù)，抗原呈遞以及外界應(yīng)激等多種生理過程[6]。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，LC3-Ⅰ位于胞漿中，通過其羧基與脂質(zhì)的共價連接轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，并定位于自噬體膜上，這是自噬體形成的重要過程，當(dāng)自噬體與溶酶體結(jié)合時，LC3-Ⅰ解離循環(huán)至胞質(zhì)中，LC3-Ⅱ則依舊位于自噬溶酶體內(nèi)膜上，其含量的多少與自噬膜囊泡的數(shù)量呈正比[7]。P62蛋白在細(xì)胞中可經(jīng)自噬過程被選擇性降解，是細(xì)胞自體吞噬特異性底物。自噬被抑制中，P62蛋白的上游表達(dá)增強(qiáng)或下游降解被阻斷均可導(dǎo)致P62的大量積聚，因此P62蛋白的量可作為自噬行為的檢測指標(biāo)[8]。

自噬溶酶體的正常作用發(fā)揮需要其內(nèi)有活性的水解酶的參與，氯喹則是一種溶酶體靶向藥物，它通過抑制多種蛋白酶的活性從而抑制蛋白的水解和糖脂的代謝等多種代謝途徑，導(dǎo)致自噬體內(nèi)的物質(zhì)無法通過溶酶體降解，自噬性囊泡過度累積，溶酶體膜通透性發(fā)生改變進(jìn)而腫脹和破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[9-10]。雖然氯喹是目前少數(shù)能夠安全應(yīng)用于體內(nèi)的自噬抑制藥物之一，但其是否在各種腫瘤治療中發(fā)揮積極作用仍存在較大的爭議。

本實(shí)驗(yàn)表明LC3-Ⅱ和P62表達(dá)水平的相對增加，可能是由于氯喹抑制了自噬溶酶體的形成和自噬小體在溶酶體的降解，導(dǎo)致自噬體的累積，則LC3-Ⅱ和P62蛋白含量也相應(yīng)增加,這說明氯喹能顯著抑制小鼠肝癌細(xì)胞的自噬活性。MTT實(shí)驗(yàn)也同樣驗(yàn)證了氯喹對小鼠肝癌細(xì)胞的抑制效果。之前研究[11]已經(jīng)證明氯喹處理的肝癌細(xì)胞其自噬水平明顯降低，說明氯喹可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞的自噬從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與氯喹在其他腫瘤組織中的作用研究[12]一致，已有研究[13]證明氯喹聯(lián)合其他化療藥物使用能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

盡管氯喹在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖等方面的作用已受到廣泛的關(guān)注和研究，但其在不同動物體內(nèi)的作用劑量和機(jī)制存在較大差異，與各種化療藥物的聯(lián)合用藥也會引起不同效果，因此氯喹作為抗腫瘤輔助藥物的應(yīng)用仍需進(jìn)一步的探索與研究。