周群剛， 樊星硯， 代舒淇， 謝 蓮， 陳韶華， 徐 軍， 謝洪平*

(1.蘇州大學醫(yī)學部藥學院，江蘇蘇州 215123;2.蘇州市中心血站，江蘇蘇州 215006)

為了防止輸血感染病毒,臨床用血漿廣泛采用亞甲藍光照法對血漿病毒進行滅活，這是我國唯一獲準在臨床使用的單人份血液成分病毒滅活技術。其中，滅活袋中滅活劑亞甲藍的釋放量，是決定病毒滅活程度的關鍵參量[1]。亞甲藍釋放量過高，血漿中殘留過大，易于導致累積毒性[2]；而過低，又不能保證病毒滅活[1]。大量數(shù)據(jù)表明，亞甲藍必須保證在一個很窄的含量范圍，而我國規(guī)定為0.9～1.3 μmol/L[3]。為了盡可能方便靈敏地檢測釋放量，已經報道了大量的、基于取樣檢測的方法，包括固相萃取-分光光度法[3 - 4]、增敏熒光光譜法[5]、高效液相色譜法[6 - 7]、化學發(fā)光法[8]、共振瑞利散射光譜法[9]。但是，這些有損檢測方法，在取樣時極易導致血漿二次污染?；诖?，常常經釋放量檢測的血漿即不再用于臨床。因此，對于每一袋進入臨床的血漿，不可能均進行這樣的基于有損檢測的滅活質量控制。事實上，它的質量可靠與否僅僅是一個統(tǒng)計結果。對滅活袋中亞甲藍釋放量的無損檢測，即是實現(xiàn)每一袋血漿滅活質量控制的關鍵問題。

在本實驗室自行設計制造的透射平臺上，利用近紅外的高穿透性，結合近紅外光譜和多變量分析方法，實現(xiàn)了“非取樣方式”下的、在血漿滅活袋外對亞甲藍釋放量的快速無損透射檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

NEXUS近紅外光譜儀(美國，Thermo公司)。由蘇州市紅十字中心血站提供非滅活的、病毒陰性的多人份血漿，使用一次性病毒滅活配套裝置中的過濾器濾除白細胞，得不含亞甲藍的血漿(即空白血漿)。一次性使用血液采輸器(轉移袋，規(guī)格：35 mL,生產批號：170428，四川南格爾生物科技有限公司)。亞甲藍鹽酸鹽(分析純，基于干燥品的含量>97%，Sigma-Aldrich公司)。實驗用水為三次蒸餾水。

1.2 溶液配制

亞甲藍儲備液：稱取亞甲藍1.3953 g(分析純，干燥失重率為10.6%)，置于500 mL的容量瓶中，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)定容。精密吸取1.00 mL亞甲藍溶液，再用PBS定容至1 000 mL，即得7.8 μmol/L亞甲藍儲備液。避光、密封保存。待測樣本：首先，利用亞甲藍儲備液和PBS(pH=7.4)，采用逐步稀釋法配制一級和二級稀釋液。之后，以儲備液、稀釋液和血漿，精密配制濃度為0.312～2.959 μmol/L的亞甲藍血漿溶液共52個。最后，用一次性滅菌注射器向各血液采輸轉移袋中加注亞甲藍血漿溶液，即得待測樣本。

1.3 樣本的近紅外光譜檢測

首先，用酒精擦拭待測血液采輸轉移袋外表面和透射石英玻璃窗。之后，將血液采輸轉移袋固定在透射平臺(按中國專利201721367787.0自行設計制造)上，每次盡量將血漿袋的中間位置放置在夾套的檢測窗片處，以防止其中的空袋部分出現(xiàn)在光路中，以保證樣本的透射光譜測定。儀器參數(shù)為：波數(shù)4 000～10 000 cm-1，光程3.5 mm，分辨率8 cm-1，掃描次數(shù)32，掃描速度0.3165，光圈22，增益1。在當天檢測樣本前，用充有空氣的、未使用的血液采輸轉移袋作為光譜背景。

1.4 建立亞甲藍釋放量的多變量分析模型

首先，將檢測獲得的血漿袋中樣本的近紅外透射光譜以3 999.7～4 265.8 cm-1區(qū)間的光譜為標準進行基線漂移校準。選擇5 827.9～6 464.3 cm-1和7 467.1～9 009.9 cm-1為富信息區(qū)間，以均值中心化的光譜為模型變量，選擇主成分數(shù)為11，按濃度的高低分布隨機選擇11個樣本為預測集，以剩余的41個樣本為校正集。由于偏最小二乘法(PLS)為最為穩(wěn)健的多元分析方法之一，因此，選擇以PLS方法建立亞甲藍釋放量的多變量分析模型。

2 結果與討論

圖1 血漿袋中樣本的消除基線漂移的近紅外(NIR)透射光譜(內插圖：低波數(shù)區(qū)間的光譜，左圖為原始光譜，右圖為消除漂移的光譜)Fig.1 NIR spectra of samples in plasma bags after eliminating their baseline shifts(Insert:spectra in the range of low wavenumber, here the left for original ones and the right for shift-eliminated ones)

2.1 消除光譜基線漂移

對于近紅外光譜的低波數(shù)區(qū)域，通常將會出現(xiàn)一段光譜基線。它應該是水平線，不同濃度的樣本在該區(qū)間的光譜應該完全重疊、沒有統(tǒng)計差異，且吸收度均值為0。從我們的檢測結果(圖1)可見，在3 999.7～4 265.8 cm-1區(qū)間即為各樣本的光譜基線。然而，從原始光譜的放大圖(圖1內左插圖)可以明顯發(fā)現(xiàn)，不同濃度樣本的基線發(fā)生了漂移，漂移量約為4～11，這種與濃度無關的漂移量將對亞甲藍釋放量的準確度產生影響。對每個樣本的檢測光譜在3 999.7～4 265.8 cm-1區(qū)間的所有吸光度求均值，即得漂移量，再將該檢測光譜在各波長處的吸光度均減去該均值，即實現(xiàn)了檢測光譜的基線漂移消除，從而獲得該樣本消除漂移后的光譜(圖1)。從消除漂移后的放大圖(圖1內右插圖)可以發(fā)現(xiàn)，光譜漂移已經被有效消除。

2.2 富信息光譜與主成分數(shù)

從基線漂移消除后光譜(圖1)可以發(fā)現(xiàn)，亞甲藍血漿樣本在整個光譜區(qū)間出現(xiàn)了5 350～6 600 cm-1和7 200～10 001 cm-1兩個區(qū)間的明顯吸收峰，為吸收峰光譜區(qū)。對于前者，是由高低兩個肩峰組成，在5 350～5 828 cm-1的低波數(shù)區(qū)域，光譜不但吸收度較低，基本為無峰的水平線，且出現(xiàn)了波浪式的毛刺，這類低信噪比的光譜信號將影響定量分析模型的精密度。而高波數(shù)區(qū)間6 464～6 600 cm-1的光譜，為該吸收峰的末端光譜，吸收度較低，信號較弱，同樣也表現(xiàn)為低信噪比。因此，選擇該吸收峰光譜區(qū)5 827.9～6 464.3 cm-1的光譜為富信號光譜。同理，在7 200～10 001 cm-1吸收峰光譜區(qū)，選擇7 467.1～9 009.9 cm-1的光譜為富信號光譜。

以5 827.9～6 464.3 cm-1和7 467.1～9 009.9 cm-1的光譜為富信息光譜，以均值中心化的光譜為模型變量，以校正集樣本按leave-one-out的交互檢驗，計算不同主成分數(shù)時PLS模型預測亞甲藍濃度的殘差(圖2)。我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著主成分數(shù)的增加，預測的濃度殘差具有逐漸減小的趨勢，表明模型的準確性逐漸增高。當主成分數(shù)≥11以后，預測殘差減小的程度明顯變小，說明主成分數(shù)繼續(xù)增加對模型準確性的貢獻率較低。當然，主成分數(shù)過大也會導致模型的過擬合，因此，選擇11為主成分數(shù)。

2.3 釋放量的多變量分析模型與非損傷檢測的準確度

以選擇的兩個區(qū)間的富信息光譜為亞甲藍釋放量的識別變量，基于前述確定的主成分數(shù)，經光譜均值中心化，利用PLS方法建立釋放量的多變量分析模型，其中按亞甲藍濃度的高低分布，隨機選擇11個樣本為預測集，其余的41個為校正集，結果參見圖3?？梢园l(fā)現(xiàn)，在多變量分析模型中，校正樣本的校正濃度與真實濃度能夠較好地相互對應，在整個檢測濃度區(qū)間，它們均分布在真實濃度(對角線)附近，其相關系數(shù)Rcorr=98.16%。利用建立的模型，對獨立的預測集樣本中的亞甲藍釋放量進行預測(即測定)，也不難發(fā)現(xiàn)，這些樣本的預測濃度仍然表現(xiàn)出了良好的對應關系，它們也能夠分布在真實濃度的附近，其相關系數(shù)Rpred高達98.93%。由此表明，建立的模型應該具有良好的準確度。

圖2 基于leave-one-out的交互檢驗的PLS模型的殘差Fig.2 Residual of PLS model of cross-validation based on leave-one-out approach

圖3 釋放量的多變量分析模型Fig.3 Multivariate analysis model of the release amount of methylene blue:calibration sample;·:prediction sample.

為了進一步說明模型的準確度，我們設計了高中低濃度組的樣本，進行了回收率試驗，結果見表1。從表1可見，無論濃度高低，各濃度組均有良好的回收率，回收率在103.6%～110.8%之間，且沒有濃度高低相關性，具有隨機性，說明建立的無損檢測方法準確、可靠。當然，最低回收率低至96%，而最高則高達119%，這對于一個無損的、快速檢測方法，特別是生物樣本的檢測，這完全是一個可以接受的準確度。事實上，為了避免血漿的基質干擾可能會因不同人而存在微小差異，我們采用了10人份的血漿作為空白。在這種多人份血漿基質干擾的情況下，分析模型仍然保證了良好的準確性。當然，由于本文的樣本量還較少，只能說明檢測平臺和檢測方法的可行性，為實際的質量控制提供了科學性依據(jù)。若實際應用，還需要大量的樣本和大量人份的空白血漿，以保證模型的穩(wěn)健性。

表1 近紅外光譜非損傷檢測血漿中亞甲藍釋放量的準確度

3 結論

利用近紅外光的良好穿透性，在本實驗室自行設計制造的透射平臺上，采用近紅外透射光譜建立了血液采輸轉移袋中血漿病毒滅活劑亞甲藍釋放量的無損檢測方法。將在血漿袋外進行無損檢測獲得的血漿袋中樣本的近紅外透射光譜作為識別變量，以PLS方法建立了亞甲藍釋放量的多變量分析模型。模型計算濃度對各樣本濃度的相關系數(shù)分別為98.16%(校正集)和98.93%(預測集)，高中低濃度組樣本的平均回收率在103.6%～110.8%之間。在本實驗室自行設計制造的透射平臺上建立的近紅外透射光譜法能夠實現(xiàn)在血漿袋外無損、快速、準確檢測采輸轉移袋中亞甲藍的釋放量。預示著能夠在無二次污染的條件下，實現(xiàn)對采輸轉移袋中血漿病毒滅活質量的監(jiān)控。