陳云霞*， 閆 妍， 蘇 寧， 王秀娟， 蔡天培， 鄭 君，王 聰， 劉 娟， 于紅梅

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

人體皮膚用于保護(hù)體內(nèi)各組織和器官免受外界有害因素的傷害，并能防止體內(nèi)的水分以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等成分的流失，是人體的第一道生理屏障。皮膚中的脂質(zhì)成分在保障皮膚屏障功能上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，當(dāng)皮膚脂質(zhì)成分或含量發(fā)生變化時(shí)，皮膚的屏障功能就會(huì)受到一定影響，進(jìn)而影響皮膚的生理狀態(tài)[1 - 2]。在皮膚病學(xué)領(lǐng)域，脂質(zhì)成分對(duì)人體皮膚疾病的影響已經(jīng)被證實(shí)，因此，脂類(lèi)組學(xué)的研究逐漸成為了研究焦點(diǎn)[3 - 5]。研究表明，皮膚脂質(zhì)成分的分泌過(guò)程，以及主要成分角鯊烯(Squalene)、神經(jīng)酰胺(Ceramides,CERs)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、游離脂肪酸(Free Fatty Acids,FFAs)等的含量、結(jié)構(gòu)或比例變化，都會(huì)干擾皮膚的屏障功能[6]。皮膚屏障的最外層是水質(zhì)膜，其中的脂質(zhì)成分主要來(lái)自皮脂腺和汗腺的分泌，其中角鯊烯在皮膚水質(zhì)膜中，又名三十碳六烯、鯊烯、魚(yú)肝油萜等，是一種高度不飽和三萜類(lèi)物質(zhì)，是角質(zhì)層中潤(rùn)澤脂質(zhì)，在皮膚脂質(zhì)中占12%，是皮膚保濕和抗衰老的重要指標(biāo)，因此，角鯊烯的含量變化在一定程度上能指示皮膚的生理狀態(tài)。

目前，對(duì)于角鯊烯含量的測(cè)定主要應(yīng)用于植物油、魚(yú)肝油等食品和保健品領(lǐng)域，文獻(xiàn)報(bào)道角鯊烯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[7 - 8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9 - 10]、液相色譜法[11 - 12]等。而對(duì)皮膚生物樣本中角鯊烯含量檢測(cè)鮮有報(bào)道。本研究建立了測(cè)定皮膚生物樣本中角鯊烯的氣相色譜分析及質(zhì)譜確證方法，對(duì)于皮膚病學(xué)、脂類(lèi)組學(xué)以及化妝品研究領(lǐng)域具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6890型氣相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；-80 ℃冰箱(Thermo Scitifict公司)；皮膚貼片(美國(guó)，CuDerm公司)。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；正己烷、甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg(精確至0.1 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1皮膚生物樣本制備志愿者先經(jīng)過(guò)洗頭后，平衡30 min，采用tape-striping技術(shù)用貼片取得頭皮樣本，放入2 mL的離心管中，含樣本的一側(cè)向內(nèi)，放入-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2皮膚樣本預(yù)處理向有頭皮樣本的離心管中加入1 mL正己烷，旋渦提取1 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液供氣相色譜測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1氣相色譜條件色譜柱：Agilent HP-5柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣：高純氮?dú)猓涣魉伲?.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：290 ℃，分流比：10∶1，壓力：9.85 psi，隔墊吹掃流量：3 mL/min；火焰離子化檢測(cè)器溫度：300 ℃，空氣流量300 mL/min，氫氣燃?xì)饬髁浚?0 mL/min，尾吹氣流量：25 mL/min；升溫程序：250 ℃保持1 min；15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min；運(yùn)行時(shí)間15 min。

1.4.2氣相色譜-質(zhì)譜確證條件氣相色譜條件：Agilent HP-5MS柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度290 ℃，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL；升溫程序?yàn)?50 ℃保持1 min；15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min；運(yùn)行時(shí)間15 min。質(zhì)譜條件:接口溫度 280 ℃；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式EI源；電離能量70 eV；全掃描監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍m/z20～500；溶劑延遲3 min。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣相色譜圖見(jiàn)圖1。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣-質(zhì)確證譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of squalene standard solution

圖2 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC-MS譜圖Fig.2 GC-MS spectrum of squalene standard solution

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理與實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1生物樣本的制備目前提取皮膚表面脂質(zhì)的方法主要是通過(guò)醫(yī)院渠道獲得角質(zhì)層碎屑，再進(jìn)行有機(jī)溶劑提取分離，或是直接在皮膚表面用合適的有機(jī)溶劑萃取皮膚表面的脂質(zhì)成分，或者直接刮取皮膚分泌物。由于上述方法取樣困難、對(duì)皮膚刺激性大，本文選擇使用脂帶法，通過(guò)涂有粘性材料的貼片貼取含有角鯊烯的皮膚樣本，放入2 mL離心管中，-80 ℃保存。

2.1.2提取溶劑的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了角鯊烯在乙腈、甲醇、正己烷、四氯化碳等有機(jī)提取溶劑的提取效果，渦旋提取時(shí)間均為1 min。角鯊烯易溶于非極性有機(jī)溶劑，經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，皮膚樣本中角鯊烯能被正己烷和四氯化碳充分提取。綜合考慮毒性和普適性，本研究選擇正己烷為最佳提取溶劑。

2.1.3提取時(shí)間的選擇在空白樣品貼片中定量添加角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，并放置至溶劑完全揮干。在2.1.1實(shí)驗(yàn)條件下，分別渦旋提取0.1、0.5、1、2、5 min，結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，提取效率先增加，但當(dāng)渦旋提取時(shí)間超過(guò)1 min后，提取率基本保持不變，因此確定渦旋提取時(shí)間為1 min。

2.1.4色譜柱的選擇角鯊烯沸點(diǎn)高，是難揮發(fā)性物質(zhì)，且易溶于非極性有機(jī)溶劑，因此本研究選擇普適性強(qiáng)，且分離該物質(zhì)良好的HP-5弱極性色譜柱。HP-5色譜柱耐高溫，柱流失小，通過(guò)較高初始柱溫，可大大縮短樣本中角鯊烯的分析時(shí)間。因此，綜合考慮色譜峰分離度和分析時(shí)間，最終選擇采用Agilent HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。

2.1.5程序升溫條件的選擇角鯊烯的沸點(diǎn)285 ℃，升溫程序?yàn)?50 ℃保持1 min，以15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min，運(yùn)行時(shí)間15 min。實(shí)驗(yàn)選擇較高的初始溫度，可以使低沸點(diǎn)物質(zhì)迅速氣化出峰，縮短目標(biāo)物的分析周期。選擇15 ℃/min的速率升至280 ℃，使得角鯊烯能夠完全出峰，并能很好避免與干擾物質(zhì)同時(shí)出峰。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系和定量限將角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋得到濃度為2、5、10、20、50、100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4節(jié)的測(cè)定條件進(jìn)樣分析，以角鯊烯的峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)的濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：Y=2.05X+0.70，相關(guān)系數(shù)為0.9998，線性范圍2～100 μg/mL方法的檢出限(S/N=3)為1 μg，定量限(S/N=10)為2 μg。

2.2.2回收率和精密度以經(jīng)過(guò)測(cè)定不含有角鯊烯的貼片空白樣品為基質(zhì)，分別進(jìn)行空白樣品添加回收率和精密度的測(cè)定。在2、4、20 μg三個(gè)加標(biāo)水平下，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，角鯊烯的平均回收率范圍為96.0%～100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.43%～3.79%。本方法在一日內(nèi)不同時(shí)間和不同日期(5 d內(nèi))測(cè)得的日內(nèi)和日間RSD分別為1%和2%。

2.3 質(zhì)譜確證

圖3 實(shí)際樣本中角鯊烯檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection result of squalene in head skin sample

陽(yáng)性樣品需用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，如果皮膚樣本中的角鯊烯色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致(變化范圍在±2.5%之內(nèi))，樣品中角鯊烯的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過(guò)2.2.2的規(guī)定，則可判斷樣品中在相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)檢出的物質(zhì)為角鯊烯。

2.4 樣品的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)共選取20例頭皮健康的志愿者(按八分法的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，該組志愿者頭屑評(píng)分≥2.5分)，其中男10例，女10例；年齡24～57歲。經(jīng)相同洗發(fā)水洗發(fā)后，再平衡30 min，用tape-striping技術(shù)進(jìn)行樣本采集，得到相應(yīng)的頭皮生物樣本。應(yīng)用本方法，對(duì)其頭皮樣本中的角鯊烯含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 結(jié)論

本文建立了皮膚生物樣本中角鯊烯的氣相色譜分析方法及氣相色譜-質(zhì)譜確證方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、回收率高、精密度好等特點(diǎn)，滿足皮膚生物樣本中角鯊烯含量測(cè)定的需求，為生物樣本中化合物的檢驗(yàn)鑒定提供了較為實(shí)用有效的分析方法，為皮膚健康狀況評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。