費佳鈺， Nguyen Thi Quynh Chau， 葉 泰， 袁 敏*， 徐 斐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

1 前言

食品衛(wèi)生安全問題是至關(guān)重要的民生問題，越來越受到世人的關(guān)注。如今，工業(yè)化進(jìn)程日益加快，由此造成的一系列的重金屬污染日趨嚴(yán)重[1]。重金屬是指相對密度大于5的金屬，如Cu、Pb、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Cd、Hg、W、Mo、Au和Ag等。盡管Mn、Cu、Zn等重金屬是生命活動所必需的微量元素，但是大部分重金屬如Hg、Pb、Cd等并非生命活動所必需，而且所有重金屬超過一定濃度都會危害人體健康。重金屬能形成復(fù)合物的形式，特別是當(dāng)它與含N、S和O的配位體生物物質(zhì)共存時，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)因氫鍵斷裂發(fā)生變化，重金屬對酶產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致酶失活，從而引起了各種不良影響[2]。事實表明，重金屬污染的危害很大，因此尋求一種簡便、高效、靈敏度高和選擇性好的重金屬檢測方法顯得尤為重要。

目前，根據(jù)不同的原理已經(jīng)有一系列檢測重金屬的方法被相關(guān)研究人員廣泛使用，比如原子吸收分光光度法[3 - 4]、原子熒光光譜法[5 - 6]、電感耦合等離子體光譜分析法[7 - 8]和X-射線光譜法[9 - 10]等。雖然這些傳統(tǒng)的檢測方法具有高靈敏度和重現(xiàn)性好的優(yōu)點[11]，但是樣品前處理通常比較復(fù)雜，往往需要濃縮、萃取和抑制其他離子干擾，儀器設(shè)備體積大且昂貴，需要專業(yè)的人員來操作，操作時間也較長，有些重金屬離子在檢測中會受其它金屬離子的干擾而無法測定[12]。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，電化學(xué)分析法有響應(yīng)速度快和靈敏度高等優(yōu)點，在重金屬的存在下，電流、電化學(xué)阻抗和電容能發(fā)生改變,這些參數(shù)變化均可實現(xiàn)對重金屬的檢測[13 - 14]。然而電化學(xué)檢測的特異性較為受限，因此電化學(xué)電極通常需要與功能材料聯(lián)用，以提高電化學(xué)性能和檢測的特異性[15]。功能材料包含無機材料、有機材料和生物材料等。其中，適配體是一種對靶標(biāo)分子有特異性結(jié)合能力的功能核酸。它通常是一段經(jīng)過體外篩選技術(shù)，即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)得到的寡核苷酸單鏈DNA或RNA片段。核酸適配體和靶標(biāo)分子在合適的環(huán)境下，通過靜電、氫鍵、疏水堆積或范德華力等作用產(chǎn)生高度的親和力，結(jié)合鏈內(nèi)某些互補堿基的配對作用，令核酸適配體發(fā)生適應(yīng)性折疊形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)[16]，如發(fā)卡(hairpin)[17]、凸環(huán)(stem loop)[18]、G-四聯(lián)體(G-quarter)[19]和T-交叉體(T-junction) 結(jié)構(gòu)[20]等。因此，適配體對靶分子具有高度特異的識別能力。此外，核酸適配體的人工合成工藝成熟、制備快速、經(jīng)濟(jì)成本低、通用性強[21]，能與生物小分子、蛋白質(zhì)、多肽、有機物及金屬離子等多種靶標(biāo)分子進(jìn)行特異性的結(jié)合[22 - 25]。在檢測重金屬方面，適配體-電化學(xué)聯(lián)用技術(shù)比單純的電化學(xué)技術(shù)展現(xiàn)了更好的特異性和更高的靈敏度，因而被廣大相關(guān)研究人員關(guān)注。根據(jù)是否應(yīng)用標(biāo)記物產(chǎn)生信號，適配體-電化學(xué)生物傳感器可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型。標(biāo)記型適配體-電化學(xué)生物傳感器又被分為三種：氧化還原電活性分子標(biāo)記型、酶標(biāo)記型和納米材料標(biāo)記型[26]。

2 非標(biāo)記型適配體-電化學(xué)生物傳感器

當(dāng)沒有標(biāo)記物存在時，傳感器獲得的電化學(xué)檢測信號往往是基于適配體探針與目標(biāo)物結(jié)合前后所導(dǎo)致的傳質(zhì)或電子傳遞位阻變化[26]。根據(jù)Pb2+與DNA特異性結(jié)合形成的超強G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,Gao[27]等使用硫堇作為信號分子，以石墨烯作為信號增強的平臺，構(gòu)建非標(biāo)記適配體-電化學(xué)生物傳感器。該傳感器首先基于石墨烯的六角形與堿基的平面結(jié)構(gòu)之間的π-π堆積相互作用，將石墨烯組裝到電極上，然后通過更強的π-π作用進(jìn)一步將硫堇吸附到石墨烯表面，形成了Pb2+識別層。當(dāng)Pb2+存在的時候，電極表面的ssDNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榭烧郫B的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，石墨烯的親和力下降，石墨烯-琉堇復(fù)合物從感測接口釋放，導(dǎo)致傳感器的氧化還原信號減少。在最佳實驗條件下，峰值電流的衰減與Pb2+濃度(1.6×10-13到1.6×10-10mol/L)的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限約為3.2×10-14mol/L。這種傳感器表現(xiàn)出良好的再生性和可接受的再現(xiàn)性，說明它能被良好地運用在重金屬檢測上。崔琳等[28]通過Au-S鍵將適配體自組裝在絲網(wǎng)印刷碳電極上構(gòu)建了非標(biāo)記型適配體-電化學(xué)傳感器。這里的適配體是Ars-3，它可以通過靜電相互作用吸附陽離子聚二烯丙基二甲基胺(PDDA)以排斥其他陽離子。通過圓二色譜測量，表明As(Ⅲ)可以結(jié)合Ars-3上一些堿基并改變其構(gòu)象，抑制了具有脫氧核糖堿基間強的π-π*轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致PDDA的吸附減少，因此可以吸附更多帶正電荷的電化學(xué)活性指示劑，檢測的敏感度增強。在最佳條件下，檢出限低至1.5×10-10mol/L。此傳感器結(jié)合了一次性絲網(wǎng)印刷電極，具有成本效益。

3 標(biāo)記型適配體-電化學(xué)生物傳感器

隨著如今分子標(biāo)記技術(shù)的日益成熟，標(biāo)記型適配體-電化學(xué)傳感器被運用的也越來越廣，適配體或靶分子被標(biāo)記修飾后，傳感器的檢測更靈敏。

3.1 氧化還原電活性分子標(biāo)記型

適配體本身電化學(xué)信號比較微弱，可以通過物理吸附、化學(xué)吸附、共價鍵合、生物親和等各種手段將各種具有電化學(xué)氧化還原活性或催化活性的信號分子修飾到靶分子上，從而增強電化學(xué)信號，這類電活性物質(zhì)，如二茂鐵(Fc)和亞甲基藍(lán)(MB)等，在檢測過程中以目標(biāo)分子結(jié)合適配體導(dǎo)致的電化學(xué)信號衰減程度作為定量的標(biāo)準(zhǔn)。Zhuang等[29]報道了基于Hg2+誘導(dǎo)的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中在每個發(fā)夾環(huán)的中間用Fc氧化還原標(biāo)記物標(biāo)記。當(dāng)Hg2+存在時，Hg2+介導(dǎo)的堿基從粘性末端到打開發(fā)夾，發(fā)生的構(gòu)象變化導(dǎo)致Fc靠近電極以增加氧化還原電流。T-Hg2+-T的強配位反應(yīng)具有良好的重復(fù)性，檢測到的Hg2+動態(tài)濃度范圍為5.0×10-9mol/L至1.0×10-6mol/L，檢測限為2.5×10-9mol/L。Wu等[30]將Fc修飾在DNA末端，設(shè)計一條與其互補的DNA鏈，通過Au-S鍵固定在Au電極上，當(dāng)Hg2+不存在時，兩條DNA鏈互補，F(xiàn)c靠近Au電極，得到強的電化學(xué)信號，當(dāng)Hg2+存在時，Hg2+與DNA特異性結(jié)合，導(dǎo)致兩條鏈分離，F(xiàn)c遠(yuǎn)離Au電極，電化學(xué)信號減弱，完成了對Hg2+的檢測。該電化學(xué)生物傳感器檢測限6.0×10-11mol/L。Wen等[31]利用MB作電化學(xué)信號標(biāo)記，通過ssDNA誘導(dǎo)的構(gòu)象變化檢測亞砷酸鹽，檢測限為1.0×10-9mol/L。利用相同原理檢測重金屬離子的研究還有很多,設(shè)計的這些傳感器都有很好的選擇性和靈敏度，所用的適配體長度也在不斷縮短，找到最容易結(jié)合的位置，目的是進(jìn)一步提高靈敏度。

3.2 納米材料標(biāo)記型

納米材料，是指其結(jié)構(gòu)單元的尺寸介于1～100 nm范圍之間的一種新型的特殊材料。納米顆粒材料自20世紀(jì)70年代問世以來，憑借其獨特的表面效應(yīng)、導(dǎo)熱性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì)等受到人們的廣泛關(guān)注，被運用到各個領(lǐng)域，掀起了研究熱潮[32]。

3.2.1納米粒子標(biāo)記型納米粒子具有易于合成、粒徑小、占比面積大以及表面自由能高[33]等特性，提高了重金屬檢測的靈敏度。根據(jù)納米材料種類，納米粒子標(biāo)記型又可以分為金納米粒子(AuNPs)標(biāo)記型和量子點(QDs)標(biāo)記型。AuNPs具有生物相容性、高電子密度、介電特性、催化作用、熒光猝滅效應(yīng)、光熱轉(zhuǎn)換、表面增強拉曼散射效應(yīng)和表面等離激元共振效應(yīng)(SPR) 等特性[34]，這些優(yōu)勢使其被廣泛運用在疾病診斷、生物及食品安全檢測等方面[35 - 37]。Wang等[38]開發(fā)了一種基于胸腺嘧啶(T)修飾的金納米顆粒/還原氧化石墨烯(AuNPs/rGO)納米復(fù)合材料可重復(fù)利用的電化學(xué)傳感器，用于檢測Hg2+。當(dāng)Hg2+存在時，T堿基和Hg2+的特異性結(jié)合形成T-Hg2+-T配合物相互作用，AuNPs/rGO納米復(fù)合材料將電化學(xué)信號放大，檢出范圍為5.0×10-11～5.0×10-6mol/L，檢測限低至7.0×10-12mol/L。運用同樣的T-Hg2+-T 的特異性結(jié)合，Wang等[39]開發(fā)了基于T-Hg2+-T復(fù)合物和三螺旋DNA的電化學(xué)傳感器檢測Hg2+,AuNPs與游離的ssDNA結(jié)合,同時AuNPs上的其他游離的ssDNA可以在Ag+的存在下結(jié)合，形成穩(wěn)定的胞嘧啶-Gly-胞嘧啶(C-Ag+-C)復(fù)合物和環(huán)擴(kuò)增，大量的C-Ag+-C可以通過電化學(xué)還原形成銀納米團(tuán)簇，獲得Ag+溶出伏安信號，AuNPs可以加速銀剝離，從而使電信號放大來測得Hg2+濃度，該傳感器可以在1.0×10-10至1.3×10-7mol/L范圍內(nèi)檢測，檢出限為3.0×10-11mol/L。Chen等[40]將AuNPs固定在Au電極上放大電化學(xué)信號，和不固定AuNPs對比[41]，發(fā)現(xiàn)對Cu2+檢測限明顯降低。

量子點(QDs)是指元素周期表Ⅱ-Ⅳ或Ⅲ-Ⅴ族的半導(dǎo)體納米材料[42]，主要為復(fù)合結(jié)構(gòu)或多層核殼結(jié)構(gòu)，具有一些獨特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，如窄尺寸分布、高量子化、尺寸依賴性吸收和光致發(fā)光等[43]。QDs標(biāo)記型傳感器通過適當(dāng)?shù)姆椒▽Ds標(biāo)記到適配體或靶分子上，利用測量傳感器上結(jié)合的QDs組分中重金屬的含量，從而測出靶分子中重金屬的含量，這種傳感器可以實現(xiàn)多組分的同步測定。例如，Lu等[44]報道了一種基于CdSe QDs標(biāo)記ssDNA的電化學(xué)發(fā)光傳感器。實驗中先通過經(jīng)典的Au-S鍵將DNA組裝到電極上，再通過酰胺鍵將末端氨基標(biāo)記的DNA連接到羧化的CdSe QDs。當(dāng)Pb2+存在時，富含G堿基的單鏈會折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，使得CdSe QDs與Au電極之間的距離縮短，從而降低電化學(xué)發(fā)光強度。在一定范圍內(nèi)，Pb2+濃度與電化學(xué)發(fā)光強度呈現(xiàn)正相關(guān)，因此可以利用這種傳感器檢測Pb2+的含量。該傳感器的檢測范圍為1.0×10-10～1.0×10-8mol/L,檢出限為1.0×10-10mol/L。Hu等[45]報道了一種同時使用AuNPs和CdTe QDs標(biāo)記的適配體-電化學(xué)傳感器，用于檢測Hg2+。當(dāng)Hg2+不存在時，適配體吸附在AuNPs表面，防止鹽誘導(dǎo)的AuNPs發(fā)生聚集，導(dǎo)致CA-CdTe QDs的熒光猝滅；當(dāng)Hg2+存在時，適配體與Hg2+高度特異性結(jié)合形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，AuNPs形成藍(lán)色聚集體，藍(lán)色聚集體不能猝滅CA-CdTe QDs的熒光，猝滅的熒光被恢復(fù)，熒光猝滅的程度隨有效猝滅劑數(shù)量的減少而減少，CA-CdTe QDs的熒光強度隨Hg2+量的增加而恢復(fù)，熒光強度與Hg2+的濃度成線性比例關(guān)系。這種傳感器的檢測范圍在5.0×10-11至1.0×10-9mol/L內(nèi)，檢出限為2.5×10-12mol/L。

3.2.2石墨烯石墨烯(Graphene)是一種由碳原子構(gòu)成的單層片狀結(jié)構(gòu)的新材料，是以sp2雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜[46]。石墨烯和核堿基之間能產(chǎn)生疏水和π-π堆疊相互作用，氧化石墨烯納米片可以有效地結(jié)合單鏈DNA[47]，可以防止單鏈DNA從石墨烯表面解離出來[48]，Hg2+可以特異性地結(jié)合DNA的兩個胸腺嘧啶(T)殘基以形成T-Hg2+-T復(fù)合物。根據(jù)這個原理，Lu等[49]通過氧化石墨烯納米片指示劑標(biāo)記的聚-T(15)寡核苷酸誘導(dǎo)目標(biāo)解離，在T-Hg2+-T配位結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對Hg2+進(jìn)行測定，檢出限為1.2×10-10mol/L。這種方法實驗的重現(xiàn)性比較好，能有效地篩選出水樣中的Hg2+。

3.3 DNA酶標(biāo)記型

酶具有高效的催化效應(yīng)，各種各樣的蛋白酶、DNA酶和RNA酶被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記不同的生物傳感器。在重金屬檢測中，運用得較多的是DNA酶。DNA酶的穩(wěn)定性更高，經(jīng)過多次變性、復(fù)性之后活性也不受影響，具有較強的識別能力。但是單個DNA酶的催化活性并不高，只有當(dāng)它與核酸、氨基酸或金屬離子等輔助因子結(jié)合時，才能發(fā)揮出高效的活性，進(jìn)而可以被用于檢測重金屬離子。根據(jù)GR-5酶對Pb2+具有較好的選擇性這一特點,Gao等[50]基于GR-5前導(dǎo)-依賴性DNA酶建立了檢測Pb2+的電化學(xué)傳感器，當(dāng)Pb2+存在時，底物在易裂解的核糖腺苷切割成兩個片段，發(fā)生DNAzyme的解離，導(dǎo)致插入的Ru[(phen)3]2+的釋放，同時伴隨著電化學(xué)發(fā)光強度的降低，可以從發(fā)光強度的減少來計算Pb2+的量,檢出限為9.0×10-13mol/L。除此之外，還有很多研究學(xué)者也利用了DNA酶與重金屬結(jié)合的原理實現(xiàn)重金屬離子的檢測[51 - 53]，這種傳感器是一種新興的檢測技術(shù)，具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 結(jié)論與展望