張惠賢, 童 圓， 胡西洲， 彭立軍， 彭西甜*,， 馮鈺锜

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北武漢 430064；2.生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室，武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢 430072)

真菌毒素是產(chǎn)毒霉菌在一定條件下產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，研究結(jié)果表明一些真菌毒素對動物和人類會造成嚴重的危害[1 - 2]。黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是谷物、豆類和堅果中最常見的一類真菌毒素，主要有AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2等，其中AFT B1的毒性最強，是目前發(fā)現(xiàn)的致癌力最強的天然物質(zhì)[3 - 4]。我國規(guī)定AFT B1在谷物及其制品中最大殘留限量(MRL)為5～20 μg/kg[5]。近年來，由于全球的氣候變暖，谷物被真菌毒素侵害的程度及范圍均呈上升趨勢。因此，開發(fā)簡單、準確、靈敏的谷物中AFT B1的檢測方法對于保障糧食安全非常重要。

食品中AFT常見分析方法有酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)[6 - 7]、薄層色譜法(TLC)[7 - 8]、膠體金試紙條法[9]、高效液相色譜法(HPLC)[2,4,10 - 12]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13 - 15]。ELISA法具有靈敏度高、特異性強、成本低、快捷，且熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對結(jié)果無干擾等優(yōu)點，但是由于其試劑壽命短、需低溫保存、假陽性概率較高，主要用于樣品的初步篩查；TLC法操作步驟繁瑣、重現(xiàn)性不好，常用于AFT的定性分析；LC-MS/MS法選擇性好，適合多殘留的分析，然而其共洗脫的干擾物會對目標分析物的離子化效率產(chǎn)生影響，影響了分析方法的準確性[16]。目前，高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)是AFT分析最常用的分析方法，該法具有靈敏度高、選擇性好，且分析成本較LC-MS/MS低[17]的優(yōu)點。在熒光檢測中，AFT B1分子二呋喃結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵的吸電子誘導效應，使分子熒光減弱，降低了方法靈敏度，而通過化學衍生的方法使雙鍵變?yōu)閱捂I可以增強AFT B1的靈敏度，相比于柱前衍生，柱后衍生步驟簡單，特別是光化學的柱后衍生，無需使用化學試劑，大大簡化了衍生的步驟[18]。

谷物類樣品基質(zhì)復雜，而AFT的濃度較低，因此在儀器分析前使用合適的樣品前處理技術(shù)是非常必要的。目前，常見的黃曲霉毒素的分離富集有液-液萃取[19 - 20]、固相萃取[2,21]、免疫親和萃取[22]等方法。本文采用AFT專用固相萃取柱，結(jié)合光化學柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測法，建立了一種谷物中AFT B1的分析方法。該方法操作簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高，且成本較低，適合谷物中AFT B1的批量分析檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

AFT B1標準溶液(10.0 mg/L)，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)；色譜純的丙酮、乙腈、正己烷、甲醇，購自德國默克公司；HiCapt Afb AFT專用固相萃取柱(100 mg，3 mL)和HiSep C18-T色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，購自維泰克科技(武漢)有限公司；其它試劑均為分析純，超純水由Milli-Q純水儀(Millipore,Billerica,MA,USA)制備。

不同的大米和小麥樣品購自武漢市內(nèi)的農(nóng)貿(mào)市場和超市。

1.2 標準儲備液的制備

將AFT B1標準溶液(10.0 mg/L)用甲醇配制成200 μg/L的AFT B1標準儲備液，4 ℃冰箱避光保存。將AFT B1標準儲備液用乙腈∶水(1∶1，V/V)稀釋，配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的標準系列溶液。

1.3 樣品制備

準確稱取粉碎均勻的谷物樣品2.0 g于50 mL離心管中，加入10 mL超純水和20 mL乙腈，渦旋混合2 min，超聲提取20 min。加入5.0 g NaCl，渦旋混合2 min，于6 000 r/min離心5 min，收集10 mL上清液，減壓蒸干，加入2.5 mL二氯甲烷，渦旋1 min，加入2.5 mL正己烷，待凈化。

在HiCapt Afb柱(100 mg，3 mL)中依次加入5 mL丙酮、3 mL正己烷-二氯甲烷(1∶1，V/V)活化萃取柱后，加入5 mL待凈化液，待上樣液完全流出后，用6 mL乙酸乙酯-正己烷(3∶7，V/V)混合溶劑清洗，減壓抽干，用8 mL丙酮解吸AFT B1，收集解吸液，40 ℃氮氣吹干，1 mL乙腈-水(1∶1，V/V)定容，0.22 μm濾膜過濾至進樣瓶中，待上機分析。

1.4 儀器與色譜條件

LC-20A高效液相色譜儀(日本，Shimazu公司)；IKA MS1 Minishake漩渦振蕩器(德國，IKA公司)；Anke TDL-40B型離心機(上海安亭儀器廠)；BSA2202S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；OA-SYS氮吹儀(美國，Organomation公司)。色譜工作條件：HiSep C18-T色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈-水(1∶1，V/V)，0.8 mL/min；熒光檢測器：激發(fā)波長為384 nm，發(fā)射波長為406 nm；進樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

采用反相的HiSep C18-T柱分離AFT B1，優(yōu)化了流動相乙腈-水的比例對AFT B1分離的影響，發(fā)現(xiàn)當乙腈-水的體積比為1∶1時，AFT B1同樣品基質(zhì)中的干擾物基線分離，并且保留時間較短。

AFT B1遇水熒光易猝滅，影響了分析的靈敏度，需要采用衍生方法加強其熒光信號。目前常用的衍生方法有三種：三氟乙酸衍生法、碘衍生法和光化學柱后衍生法。三氟乙酸柱前衍生法操作繁瑣，而柱后碘衍生法需要衍生泵，還需配制衍生溶液。本文使用柱后光化學衍生，只需在色譜柱與檢測器之間連接光衍生反應器，使AFT B1與流動相中的水反應，從而在分子中引入給電子基團羥基，大大增加了AFT B1熒光檢測的靈敏度，且操作簡單，穩(wěn)定性好[18]。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

圖1 5.0 μg/L AFT B1標準溶液(a、d)、空白小麥和大米樣品(b、e)以及加標5.0 μg/kg的AFT B1的空白小麥和大米樣品(c、f)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of aflatoxin B1 standard solution(a,d),blank wheat and rice samples(b,e) and blank wheat and rice samples with aflatoxin B1 at a 5.0 μg/kg spiked level(c,f)

AFT B1具有一定的極性，本研究采用中等極性的乙腈作為提取溶劑，其在無機鹽的作用下易與水相分層，從而除去了樣品中水溶性大的干擾物，同時保證了AFT B1的提取回收率在70%以上。樣品提取完成后，采用不同比例的正己烷-二氯甲烷溶解AFT B1，固相萃取柱凈化。當采用100%的正己烷或者100%的二氯甲烷時，AFT B1的萃取回收率都低于70%。這可能是由于100%的正己烷無法完全溶解AFT B1，而100%的二氯甲烷在固相萃取柱中對AFT B1是一種較強的洗脫溶劑，因此回收率較低。而采用正己烷-二氯甲烷(1∶1，V/V)時，可以較好溶解AFT B1，同時保證后續(xù)在固相萃取上樣過程中不會將AFT B1洗脫，從而得到較高的回收率。

在最優(yōu)化的條件下，小麥和大米中AFT B1標樣的色譜圖、空白色譜圖、加標色譜圖見圖1，從圖中可以看出經(jīng)HiCapt Afb柱萃取凈化后，AFT B1的分析沒有樣品基質(zhì)的干擾。

2.3 方法學考察

2.3.1線性方程及檢出限將制備好的系列標準溶液按優(yōu)化好的色譜條件分析，平行測定三次，計算峰面積的平均值，以峰面積X對質(zhì)量濃度Y(μg/kg)作圖，得到線性回歸方程：Y=4×10-5X-0.2399，AFT B1的質(zhì)量濃度在0.5～50 μg/kg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.9999)。以信噪比的3倍和10倍計算出檢出限和定量限，分別為0.03 μg/kg和0.1 μg/kg。我國規(guī)定AFT B1在小麥和大米中MRL分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，該方法的靈敏度可以滿足兩種谷物中AFT B1的分析要求。

2.3.2回收率和精密度準確稱取2.0 g空白的小麥及大米樣品，分別加入1.0、5.0、10.0 μg/kg的AFT B1，按照最優(yōu)的前處理和色譜條件分析，計算加標回收率，結(jié)果見表1。小麥和大米中AFT B1低、中、高三種加標濃度的回收率在78.5%～94.8%之間，日內(nèi)、日間相對標準偏差(RSD)低于7.2%，表明該方法具有很好的準確度和精密度。

表1 谷物中AFT B1分析的低中高添加回收率和精密度

2.4 實際樣品的測定

在武漢市場分別購買了5種不同的小麥和大米樣品，在優(yōu)化的條件下采用本方法對這些樣品中的AFT B1進行分析，均未檢出AFT B1殘留。

3 結(jié)論

本文建立了一種谷物中AFT B1的固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測方法。樣品用乙腈水溶液提取、鹽析分層、濃縮，黃曲霉毒素專用固相萃取柱凈化富集，高效液相色譜-柱后光化學衍生-熒光檢測。在最優(yōu)條件下，谷物中AFT B1在0.5～50 μg/kg線性關(guān)系良好，低、中、高三種濃度的添加回收率在78.5%～94.8%之間，日內(nèi)、日間RSDs低于7.2%，表明該方法具有很好的準確度和精密度。與傳統(tǒng)的AFT B1分析方法相比，本文方法操作簡便，穩(wěn)定性好，有機溶劑消耗少，檢測成本低。