弓 輝， 李雪冰， 呂俊杰， 王茹林， 卞 偉*

(山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，山西太原 030001)

碳點(Carbon Dots,CDs)是一種粒徑分布在10 nm以下的新型熒光碳納米材料，形狀近乎準球型。CDs因其良好的光學性能、表面的易于修飾、制備的成本低、良好的生物相容性以及較低的細胞毒性等優(yōu)良性能，在熒光探針、生物成像和藥物分析等領(lǐng)域得到了廣泛的應用[1 - 3]。但一些CDs存在量子產(chǎn)率低和背景干擾性較大等缺點，極大地影響了其在生物成像方面的應用。研究者為了提高CDs的量子產(chǎn)率，提出了非金屬雜原子或金屬元素摻雜、表面功能化、官能團的修飾等多種方法。其中，非金屬雜原子的摻雜簡便綠色，備受人們的關(guān)注。如Zhang等[4]以四種具有代表性的微生物作為綠色碳前體，合成了N、P、S共摻雜CDs，并成功用于細胞內(nèi)Cr(Ⅵ)和抗壞血酸(AA)的檢測;ZENG等[5]以甲硫氨酸為原料，通過一步水熱法合成了具有良好發(fā)光性能的N摻雜CDs，并成功用于細胞成像。

姜黃素的分子式為C21H20O6，它是一種二酮類化合物，具有抗炎[6]、抗氧化[7]、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤[8]等重要的生理和藥理作用，因此，姜黃素在心腦血管疾病、消化系統(tǒng)疾病上有非常廣泛的應用價值，引起國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。目前檢測姜黃素的方法有反相液相色譜法[6 - 8]、分光光度法[9]、高效液相色譜法[10]。本文以一水合檸檬酸和L-半胱氨酸為原材料，經(jīng)微波加熱合成了N、S共摻雜碳點(NSCDs)。采用透射電子顯微鏡(TEM)、傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜、紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜對合成的摻雜CDs進行了表征。在最佳的實驗條件下，根據(jù)姜黃素對NSCDs的熒光猝滅現(xiàn)象，建立了一種檢測姜黃素含量的方法，并應用于檢測實際尿樣和血樣中的微量姜黃素。初步探究了NSCDs與姜黃素的作用機理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEM-1011型透射電子顯微鏡(TEM)(日本，JEOL)；Paragon 1000型紅外光譜儀(美國，Perkin-Elmer公司)；TU-3900型雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；FB124型電子分析天平(北京普析通用儀器有限責任公司)；pHSJ-3F型酸度計(上海壘固儀器有限公司)。

姜黃素(上海化學試劑總廠)；NaH2PO4·2H2O(天津博迪化工廠)；Na2HPO4·2H2O(天津博迪化工廠)；Na3PO4·12H2O(天津博迪化工廠)；無水乙醇(天津市天新精細化工開發(fā)中心)；實驗所用試劑均為分析純。實驗用水為去離子水。

1.2 氮硫共摻雜碳點(NSCDs)的制備

取0.5 g一水合檸檬酸和0.5004 g半胱氨酸，溶解于含有20 mL去離子水的小燒杯中，將小燒杯置于微波爐中反應2.5 min，得到黃色固體。將固體置于室溫下冷卻，加入20 mL去離子水攪拌溶解，過濾，再將得到的濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾。然后把所得濾液用透析膜(MWCO=1 000 Da)透析12 h，得到淺黃色NSCDs的溶液，在4 ℃的冰箱中保存，備用。

1.3 姜黃素的檢測方法

在5 mL的比色管中，加入10 mmoL/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.8)，濃度為3.0 mg/mL的NSCDs溶液和不同濃度的姜黃素標準溶液，混合搖勻。室溫下反應7 min后，測定體系的熒光強度，記錄熒光光譜。熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置為：發(fā)射波長為345 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 NSCDs的表征

通過透射電子顯微鏡(TEM)、傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜、紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜和熒光光譜對NSCDs進行了表征。從TEM圖(圖1)中可以看到NSCDs形狀近似球形，單分散，粒徑分布在3.5～4.5 nm之間。在NSCDs的傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜圖中(圖2)，644 cm-1處的吸收峰是C-S鍵的伸縮振動；C-S鍵的彎曲振動的吸收峰位于986 cm-1處；C-O鍵與C-N鍵的彎曲振動峰分別為1 232 cm-1、1 392 cm-1；1 714 cm-1和1 538 cm-1處的吸收峰分別對應的是C=O、C=C的伸縮振動；2 934 cm-1處的吸收峰是C-H 鍵的伸縮振動引起的；同時可以明顯看到3 434～3 350 cm-1處有較寬的吸收峰，說明此處有O-H與N-H鍵的伸縮振動。

圖3為NSCDs的紫外-可見吸收光譜及熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。由圖可知，NSCDs的最大紫外吸收峰為320 nm，這是由于CDs中C-OH鍵的n-π*躍遷產(chǎn)生的[11]。當激發(fā)波長為345 nm，NSCDs在420 nm有最大的熒光發(fā)射峰。圖4為NSCDs放置48 h后熒光強度的變化，由圖可知NSCDs的熒光強度基本不改變，表明制備的NSCDs較為穩(wěn)定。

圖1 NSCDs的透射電鏡(TEM)圖(內(nèi)插圖為NSCDs的粒徑分布圖)Fig.1 TEM image of NSCDs(The inset is the particle size distribution of NSCDs)

圖2 NSCDs的紅外(FT-IR)光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of NSCDs

綜合TEM、FT-IR光譜和UV-Vis吸收光譜的實驗結(jié)果，表明NSCDs已成功制備。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1pH的影響實驗探究了不同pH值的PBS對NSCDs以及NSCDs-姜黃素體系熒光強度的影響，結(jié)果如圖5。由圖可知pH在4.0～7.8范圍內(nèi)，隨著pH的增大，NSCDs的熒光強度增大且在pH=7.8時達到最大值，pH在7.8～11.0范圍內(nèi)，NSCDs的熒光強度迅速降低。加入姜黃素后，NSCDs-姜黃素體系的熒光強度變化趨勢與NSCDs熒光強度的增減趨勢相似，在pH值為7.8時熒光強度達到最大。因此，選擇pH=7.8的PBS進行后續(xù)實驗。

圖3 NSCDs的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜(1)與熒光激發(fā)(2)和發(fā)射光譜(3)Fig.3 UV-Vis absorption spectra(1),fluorescence excitation (2) and emission (3) spectra of NSCDs

圖4 NSCDs的穩(wěn)定性實驗(放置48 h)Fig.4 The stability experiment of NSCDs(48 h)

2.2.2NSCDs濃度的影響在pH=7.8的條件下，探究了不同濃度的NSCDs對姜黃素檢測的影響，見圖6。由圖6可知，在2.0～3.0 mg/L范圍內(nèi)，NSCDs的熒光強度變化(F0/F)與姜黃素濃度(c)的線性關(guān)系符合Stern-Volmer方程，方程的斜率隨著NSCDs濃度的升高逐漸變大，在NSCDs的濃度為3.0 mg/L時方程的斜率達到最大。繼續(xù)增大NSCDs的濃度，方程的斜率逐漸減小。因此，選擇濃度為3.0 mg/L的NSCDs作為實驗最佳濃度。

圖5 pH對NSCDs以及NSCDs-姜黃素體系熒光強度的影響(姜黃素的濃度為3.33×10-7 moL/L)Fig.5 Effect of pH on fluorescencec intensity of NSCDs and NSCDs-curcumin system(the concentration of curcumin is 3.33×10-7 moL/L)

圖6 NSCDS的濃度對NSCDs-姜黃素體系F0/F的影響Fig.6 Effect of the concentration of NSCDs on F0/F NSCDs-curcumin system

2.2.3反應時間的影響在pH=7.8和NSCDs濃度為3 mg/L的條件下，探究了反應時間對NSCDs-姜黃素體系熒光強度的影響。由圖7可知，加入姜黃素后NSCDs的熒光強度迅速降低，反應時間在7 min時NSCDs熒光強度降到最小，反應在7～60 min之間熒光強度時基本保持不變。選擇7 min為后續(xù)實驗的反應時間。

2.3 姜黃素濃度對NSCDs摻雜碳點熒光光譜的影響

在最佳實驗條件下，探究了不同濃度的姜黃素對NSCDs熒光強度的影響如圖8。隨著姜黃素濃度不斷增大，NSCDs的熒光強度逐漸下降。

圖7 反應時間對NSCDs-姜黃素體系熒光強度的影響Fig.7 Effect of reaction time on fluorescence intensity of NSCDs- curcumin system

圖8 姜黃素濃度對NSCDs熒光強度的影響(內(nèi)插圖為校正曲線)Fig.8 Effect of curcumin concentration on fluorescence intensity of NSCDs(Inset:the calibration curve)c(1 - 15):0.2 - 15 μmol/L.

姜黃素的濃度在0.2～15 μmoL/L范圍內(nèi)與NSCDs的熒光強度的變化符合Lineweaver-Burk方程，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9920，檢出限為62 nmoL/L。加入10 μL姜黃素重復測定11次所得的相對標準偏差為0.65%。

2.4 共存物質(zhì)的干擾性實驗

在上述最佳的實驗條件下，探究了常見金屬離子和各種氨基酸對姜黃素猝滅NSCDs熒光強度的影響，結(jié)果如表1所示。由表可知，常見的金屬離子和各種氨基酸對該體系的影響基本可以忽略，表明NSCDs對姜黃素有很好的選擇性。

表1 共存物質(zhì)對NSCDs-姜黃素體系的影響(姜黃素的濃度為3.33×10-7 moL/L)

2.5 反應機理

熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅?；鶓B(tài)熒光分子與猝滅劑之間通過弱的結(jié)合生成復合物，該復合物使熒光分子熒光完全猝滅的現(xiàn)象稱為靜態(tài)猝滅；猝滅劑與熒光激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用致使熒光強度降低的過程是動態(tài)猝滅。兩種猝滅分別用Lineweaver-Burk(1)和Stern-Volmer(2)方程表示。由于靜態(tài)猝滅中有配合物的生成，熒光物質(zhì)的紫外吸收光譜會發(fā)生變化；溫度升高，配合物的穩(wěn)定性會降低，Stern-Volmer猝滅常數(shù)減小[12]。而動態(tài)猝滅主要是由于分子之間的碰撞引起的，其紫外吸收光譜不會發(fā)生變化，Stern-Volmer猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大[13]。

1/(F0-F)=1/F+1/(KLBF0[Q])

(1)

F0/F=1+KSV[Q]

(2)

F0和F為分別為加入猝滅劑前后熒光物質(zhì)的熒光強度，[Q]為猝滅劑的濃度，KLB和KSV分別是靜態(tài)和動態(tài)猝滅常數(shù)。

由圖8可知NSCDs與姜黃素的相互作用符合Lineweaver-Burk方程。表2顯示隨著溫度的升高，NSCDs的猝滅常數(shù)減??；由圖9可以看到，將不同濃度的姜黃素標準溶液加入NSCDs溶液中，NSCDs的紫外吸收逐漸升高；圖10表示的是，向NSCDs溶液中加入不同濃度姜黃素后，其熒光壽命基本保持不變。根據(jù)以上實驗結(jié)果初步推測NSCDs與姜黃素相互作用的機理主要為靜態(tài)猝滅。

表2 不同溫度下Stern-Volmer方程的參數(shù)

圖9 不同濃度的姜黃素對NSCDs紫外-可見(UV-Vis)光譜的影響Fig.9 Effect of curcumin with different concentrations on NSCDs UV-Vis spectracurcumin concentration(1 - 5):0.0,0.2,0.6,0.8,1.3 μmoL/L.

圖10 不同濃度的姜黃素對NSCDs熒光壽命的影響Fig.10 Effect of different concentrations of curcumin on the fluorescence lifetime of NSCDscurcumin concentration(1 - 5):0.0,2.0,4.0,8.0,10.0 μmoL/L.

2.6 實際樣品分析

為了驗證該方法在實際樣品中檢測姜黃素的可行性，將不同濃度的姜黃素加入到人體尿樣和血樣中，用加標回收法進行分析，由表3知姜黃素在尿樣和血樣中的回收率在98%～102%之間，說明該方法的分析準確度良好，能夠用于實際樣品的檢測。

3 結(jié)論

本實驗以檸檬酸、L-半胱氨酸為原料在微波法加熱的條件下成功合成了NSCDs?；诮S素對摻雜碳點熒光強度的猝滅作用，建立了一種快速檢測姜黃素含量的方法。最佳實驗條件下，姜黃素的濃度在0.2～15 μmoL/L的范圍內(nèi)與NSCDs的熒光強度成良好的線性關(guān)系，其檢出限為62 nmoL/L。初步探討了姜黃素與NSCDs相互作用主要為靜態(tài)猝滅過程。將該方法應用于實際尿樣和血樣中姜黃素的測定，回收率在98.0%～102%之間，能夠用于實際樣品的檢驗。