鄧 媛， 易潤芳， 周曉東*， 胡繼明

(1.武漢大學(xué)科學(xué)技術(shù)發(fā)展研究院，湖北武漢 430072；2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

核酸適配體(Aptamer)是基于指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)的體外篩選過程產(chǎn)生了大量能與各種配體高特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA序列[1]，其空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的多樣性使其能通過靜電作用、氫鍵作用、范德華力和形狀匹配等各種作用形式與各種靶標(biāo)分子結(jié)合[2]。核酸適配體具有親和力高、特異性強(qiáng)、靶分子廣等特點(diǎn)，同時(shí)還具有化學(xué)穩(wěn)定性好、易合成和修飾等優(yōu)勢(shì)，使得這類體外篩選的核酸結(jié)構(gòu)在構(gòu)建檢測(cè)各種與生命科學(xué)、臨床診斷、藥物發(fā)現(xiàn)和環(huán)境科學(xué)相關(guān)的靶標(biāo)分子的新型傳感器方面有著重要的應(yīng)用[3 - 5]。

表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)是一種高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于生物傳感檢測(cè)領(lǐng)域[6 - 7]。SERS與適配體技術(shù)相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)特異性和敏感性的快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)，構(gòu)建一系列新型操作簡(jiǎn)便、選擇性高、精確性好的傳感平臺(tái)[8 - 10]。Wang等[11]應(yīng)用核酸適配體與SERS結(jié)合設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)凝血酶的傳感器。他們將巰基修飾后的適配體通過化學(xué)鍵結(jié)合到金基底表面，加入凝血酶和表面同時(shí)修飾了凝血酶核酸適配體鏈和拉曼染料R6G的金納米粒子(AuNPs)溶膠。凝血酶的兩個(gè)活性位點(diǎn)分別與金基底表面和AuNPs表面的核酸適配體結(jié)合，形成“三明治夾心”結(jié)構(gòu)。再通過銀沉積增強(qiáng)后檢測(cè)R6G的SERS信號(hào)實(shí)現(xiàn)凝血酶的定量分析。Yang等[12]利用末端帶有巰基的Aptamer將凝血酶捕獲，并加入對(duì)巰基苯甲酸(4-Mercaptobenzoic Acid,MBA)標(biāo)記的銀納米粒子(AgNPs@MBA)。該納米粒子通過MBA的羧基與凝血酶上的氨基發(fā)生反應(yīng)而連接在基底上，通過檢測(cè)MBA的SERS光譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的間接檢測(cè)。由上可以看出，大部分基于核酸適配體的檢測(cè)技術(shù)所需的核酸適配體都需先經(jīng)過復(fù)雜的功能化修飾和純化，通過分析修飾在標(biāo)記型核酸適配體上的信號(hào)分子，如SERS活性物質(zhì)、拉曼染料分子或熒光基團(tuán)來間接地檢測(cè)靶標(biāo)物。而修飾過后的核酸適配體價(jià)格昂貴，并可能使檢測(cè)平臺(tái)的穩(wěn)定性降低，因此，直接檢測(cè)無標(biāo)記的核酸適配體分子成為現(xiàn)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Barhoumi等[13]報(bào)道了一種可以穩(wěn)定獲得核酸適配體的SERS光譜的方法。他們發(fā)現(xiàn)DNA的SERS譜峰主要位于736 cm-1，歸屬為腺嘌呤(A堿基)呼吸模式。而Domke等[14]發(fā)現(xiàn)，DNA序列中A堿基越多，在736 cm-1處的SERS特征峰信號(hào)強(qiáng)度就越強(qiáng)，這為核酸適配體的定量檢測(cè)提供了依據(jù)。

本研究通過檢測(cè)核酸適配體的內(nèi)源SERS信號(hào)直接檢測(cè)凝血酶，構(gòu)建了一個(gè)基于無標(biāo)記核酸適配體的SERS檢測(cè)平臺(tái)，并引入MBA為內(nèi)標(biāo)，設(shè)計(jì)了一種Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針，通過核酸適配體和MBA的SERS信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的定量檢測(cè)，提供了一種快速、便捷、高選擇性的檢測(cè)凝血酶的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HR800共聚焦顯微拉曼光譜儀(法國，Jobin Yvon公司)，采譜條件：激發(fā)波長為633 nm，采用50倍長焦鏡頭，狹縫寬度50 μm，孔徑為200 μm，曝光時(shí)間20 s，積分次數(shù)3次。

凝血酶以及牛血清白蛋(BSA)均購于Sigma公司(上海)，凝血酶29個(gè)堿基的核酸適配體：5′-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3′購于生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司,HAuCl4·3H2O、檸檬酸鈉、MBA等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。緩沖溶液包括TE緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1NaCl，pH=7.4)和TBB緩沖溶液(20 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1KCl，5 mmol·L-1MgCl2，pH=7.4)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18．2 MΩ·cm)。

1.2 核酸適配體的熱預(yù)處理

核酸適配體溶解在TE緩沖溶液中，將溶液加熱到95 ℃并保持10 min，然后將溶液置于冰浴中快速冷卻。處理后的核酸適配體置于冰箱中保存，待用。

1.3 AuNPs的合成

本實(shí)驗(yàn)采用自合成的AuNPs(粒徑40 nm)，合成方法參照文獻(xiàn)方法[15]。將49.5 mL的超純水置于250 mL的兩口瓶中，加入0.5 mL濃度為1%的HAuCl4溶液，于120 ℃下加熱回流，再加入0.5 mL濃度為1%的檸檬酸三納溶液后，溶液顏色先慢慢變黑進(jìn)而變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)攪拌回流20 min，冷卻過后，將合成的AuNPs再于5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心濃縮4倍后，置于陰暗處保存待用。

1.4 Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針的合成

在玻璃管中加入880 μL上述濃縮的AuNPs溶液，再加入100 μL濃度為100 μmol·L-1的熱預(yù)處理過的Aptamer溶液，混合均勻后于室溫下放置24 h。向該體系中加入4 μL不同濃度的MBA溶液，混合均勻后放置過夜，備用。

1.5 凝血酶的檢測(cè)

將上述制得的Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針溶液于5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心15 min，移去上清液，再用TBB緩沖溶液重懸，重復(fù)兩次，以保證除凈復(fù)合物探針溶液中的未結(jié)合到AuNPs表面的Aptamer。取30 μL離心重懸后的探針溶液，分別與30 μL不同濃度的凝血酶溶液混合，于室溫下反應(yīng)3 h后，檢測(cè)拉曼光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)機(jī)制

圖1為Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針檢測(cè)凝血酶的原理和過程。MBA通過巰基與AuNPs化學(xué)鍵合，而Aptamer則通過堿基N原子與Au之間的協(xié)同配位作用有效吸附到AuNPs上，形成了Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針。該復(fù)合物探針的SERS光譜在1 075 cm-1和735 cm-1處分別出現(xiàn)明顯的MBA(苯環(huán)取代基上的C-C 伸縮振動(dòng))和Aptamer(腺嘌呤的環(huán)呼吸振動(dòng))特征峰(圖2)。當(dāng)體系中加入凝血酶時(shí)，凝血酶與Aptamer特異性結(jié)合形成G-四聯(lián)體，G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)不僅比結(jié)構(gòu)未變化的單鏈Aptamer表面電荷密度大，而且該結(jié)構(gòu)的形成阻止了Aptamer的堿基暴露于AuNPs中，因而形成的G-四聯(lián)體不易吸附到AuNPs上，從而促使核酸適配體遠(yuǎn)離金表面。由于SERS是一種長程效應(yīng)，增強(qiáng)效果與SERS基底和活性物質(zhì)間的距離相關(guān)，盡管靠近基底表面10 nm范圍內(nèi)的分子都能產(chǎn)生SERS信號(hào)，但所獲得的SERS信號(hào)仍主要來源于直接作用于基底表面的第一層信號(hào)分子的貢獻(xiàn)。因此隨著加入的凝血酶濃度的增加，越來越多的Aptamer脫離AuNPs表面，致使Aptamer拉曼信號(hào)強(qiáng)度下降，而MBA的信號(hào)峰強(qiáng)度保持不變。從而，MBA的信號(hào)峰強(qiáng)度可作為歸一化的標(biāo)準(zhǔn)，而MBA特征峰1 075 cm-1和Aptamer特征峰735 cm-1的峰強(qiáng)比(I1 075/I735)與凝血酶濃度之間的關(guān)系則可作為凝血酶定量分析的依據(jù)。

圖1 Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針檢測(cè)凝血酶的原理Fig.1 Principle of thrombin detection using Aptamer/MBA/AuNPs composite probe

圖2 Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針的SERS光譜圖Fig.2 SERS spectra of the Aptamer/MBA/AuNPs composite probe

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1熱預(yù)處理的影響本實(shí)驗(yàn)比較了分別用熱預(yù)處理前后的Aptamer制備的復(fù)合物探針的拉曼光譜。由圖3可以看出，由未經(jīng)過熱預(yù)處理的Aptamer制備的復(fù)合物探針很難觀察到735 cm-1處A堿基的環(huán)呼吸振動(dòng)譜峰，而經(jīng)過熱預(yù)處理過的Aptamer空間結(jié)構(gòu)伸展成線性構(gòu)象，大大提高了Aptamer拉曼光譜的重現(xiàn)性，且預(yù)處理過后的SERS光譜主要是腺嘌呤的拉曼光譜，相對(duì)而言其它堿基的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征譜峰要弱得多。這是因?yàn)橄汆堰实奈战孛娲笥谄渌麎A基，因此，熱預(yù)處理對(duì)Aptamer的拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)度影響巨大，同時(shí)也影響光譜的重現(xiàn)性，是檢測(cè)的關(guān)鍵所在。

圖3 未經(jīng)熱預(yù)處理的(A)和熱預(yù)處理后的(B)Aptamer制備的Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針的拉曼光譜圖Fig.3 Comparison of SERS spectra of Aptamer/MBA/AuNPs composite probe before(A) and after(B) thermal pretreatment of aptamer

2.2.2AuNPs溶液濃度的影響分別在制備得到的AuNPs原液和濃縮了4倍的AuNPs溶液中，依次加入MBA溶液放置24 h，再加入熱預(yù)處理后的Aptamer溶液，同樣放置24 h后檢測(cè)拉曼光譜。使制得的Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針溶液中Aptamer的濃度為10 μmol·L-1，且Aptamer與MBA的摩爾濃度比為20∶1，所得的拉曼光譜如圖4所示。由圖可知，未濃縮的AuNPs探針的拉曼光譜譜圖中幾乎觀察不到Aptamer的拉曼信號(hào)，而濃縮過后所制得的探針的拉曼光譜中，Aptamer和MBA都有很強(qiáng)的信號(hào)峰。推斷可能是由于Aptamer未經(jīng)濃縮的探針溶液中，AuNPs的個(gè)數(shù)較少，其表面主要被MBA分子占據(jù)，使得Aptamer分子沒有足夠的空間和位點(diǎn)結(jié)合到它的表面。而濃縮過后的AuNPs顆粒較多，兩種分子能有充足的位點(diǎn)均勻地作用到AuNPs表面。

2.2.3Aptamer和MBA修飾順序的影響Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針制備過程中，在AuNPs溶液中加入Aptamer和MBA的先后次序?qū)庾V各譜峰的信號(hào)強(qiáng)度有很大的影響。將40 nm的AuNPs溶液通過離心和重新分散的方法濃縮4倍，再加入經(jīng)熱處理后的Aptamer溶液和MBA溶液，保持兩種物質(zhì)的加入量相同，僅改變加入順序。每加入一種物質(zhì)后于室溫下放置24 h，再加入另一種物質(zhì)同樣放置24 h后，再測(cè)量所制備的復(fù)合物探針的拉曼光譜。結(jié)果如圖5所示。由圖可知，在加入量相同的情況下，Aptamer特征峰735 cm-1和MBA特征峰1 075 cm-1的峰強(qiáng)比(I735/I1 075)與加入次序的關(guān)系為：先加Aptamer的峰強(qiáng)比(I735/I1 075)>同時(shí)加入的峰強(qiáng)比>先加MBA的峰強(qiáng)比。因此，為得到Aptamer信號(hào)較強(qiáng)的探針分子檢測(cè)凝血酶，同時(shí)提高檢測(cè)的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)采用先加入Aptamer再加入MBA的順序制備Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針。

圖4 AuNPs溶液濃度對(duì)Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針的拉曼信號(hào)的影響Fig.4 Effect of concentration of AuNPs solution on SERS signal of Aptamer/MBA/AuNPs composite probea:original aptamer solution;b:concentrated aptamer solution.

圖5 Aptamer和MBA在AuNPs上修飾順序的影響Fig.5 Effect of the modifying order for aptamer and MBA to AuNPsa:Adding aptamer firstly and MBA secondly;b:Adding aptamer and MBA at the same time;c:Adding MBA firstly and aptamer secondly.

2.2.4Aptamer和MBA加入量對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響Aptamer與MBA的量在很大程度上會(huì)影響探針檢測(cè)凝血酶的靈敏度。為探討Aptamer與MBA的濃度對(duì)復(fù)合物探針靈敏度的影響，我們制備了一系列不同Aptamer與MBA摩爾濃度比(cAptamer/cMBA：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)的探針溶液，檢測(cè)其SERS光譜，結(jié)果如圖6(A)所示，不同的cAptamer/cMBA下，Aptamer的信號(hào)強(qiáng)度與MBA信號(hào)強(qiáng)度之比(IAptamer/IMBA)有明顯的的變化。作Aptamer與MBA摩爾濃度比對(duì)IAptamer/IMBA的曲線(圖6(B))，從中可知，在cAptamer/cMBA為10∶1至20∶1的濃度范圍內(nèi)IAptamer/IMBA變化最快，曲線斜率最大，即復(fù)合物探針的靈敏度最高，故選擇cAptamer/cMBA=20∶1 制備復(fù)合物探針。

圖6 Aptamer和MBA加入量對(duì)Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針靈敏度的影響Fig.6 Effect of the amount of aptamer and MBA on the sensitivity of Aptamer/MBA/AuNPs composite probe(A)SERS spectra of Aptamer/MBA/AuNPs composite probe at different cAptamer/cMBA(a to e)：10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1;(B)curves of cAptamer/cMBA vs.I735/I1 075.

2.3 凝血酶的檢測(cè)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，使用Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針對(duì)凝血酶進(jìn)行檢測(cè)。配制一系列不同濃度的凝血酶溶液，在玻璃管中加入30 μL探針溶液與30 μL各濃度的凝血酶溶液，于室溫下反應(yīng)3 h后，測(cè)量反應(yīng)后體系的SERS光譜，結(jié)果如圖7(A)所示。由圖可知，不同濃度的凝血酶與修飾有Aptamer和MBA的AuNPs復(fù)合物探針溶液反應(yīng)，凝血酶與Aptamer特異性結(jié)合形成G-四聯(lián)體，使原本吸附在AuNPs上的Aptamer遠(yuǎn)離金表面，凝血酶濃度不同，Aptamer脫離金表面的程度也不同，由于SERS的長程效應(yīng)，凝血酶濃度越大，Aptamer的SERS信號(hào)強(qiáng)度下降得越多，而1 075 cm-1處MBA的SERS強(qiáng)度則基本保持穩(wěn)定。因此，以MBA為內(nèi)標(biāo)分子，取1 075 cm-1處MBA的特征峰為歸一化標(biāo)準(zhǔn)，MBA特征峰與735 cm-1處Aptamer特征峰的相對(duì)峰強(qiáng)度(I1 075/I735)和凝血酶濃度之間的變化關(guān)系可作為凝血酶定量分析的依據(jù)。圖7(B)為不同凝血酶濃度cthrombin下的峰強(qiáng)比(I1 075/I735)，并進(jìn)行了曲線擬合，方程為：Y=0.79-1.29×X+0.63×X2，相關(guān)系數(shù)R2為0.970。凝血酶的檢測(cè)范圍為100～2 000 nmol·L-1，最低檢測(cè)濃度為100 nmol·L-1。

圖7 Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針對(duì)凝血酶的檢測(cè)Fig.7 Thrombin detection by Aptamer/MBA/AuNPs composite probe(A)SERS spectra of Aptamer/MBA/AuNPs composite probe at different cthrombin(a to f:0，100,250,500,1 000,2 000 nmol/L);(B)Polynomial fitting curve of lgcthrombin vs.I1 075/I735.

2.4 Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針對(duì)凝血酶檢測(cè)的選擇性

為驗(yàn)證Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針對(duì)凝血酶檢測(cè)是否有較高的特異性，我們?cè)贏ptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針溶液中加入同體積、不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)溶液，反應(yīng)3 h 后檢測(cè)SERS光譜(圖8)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BSA的加入對(duì)探針分子上的信號(hào)影響很小，即BSA對(duì)凝血酶的檢測(cè)無干擾，證明了Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針對(duì)凝血酶檢測(cè)具有很好的選擇性。

圖8 不同BSA濃度下Aptamer/MBA/AuNPs復(fù)合物探針的SERS光譜(A)和lgcBSA對(duì)I1 075/I735的關(guān)系曲線(B)Fig.8 SERS spectra of Aptamer/MBA/AuNPs composite probe at different cBSA (A) and curve of lgcBSA vs.I1 075/I735(B)a to f:0,100,250,500,1 000,2 000 nmol/L.

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了一種基于無任何修飾的Aptamer的SERS探針，構(gòu)建了一種基于Aptamer技術(shù)的凝血酶的SERS檢測(cè)傳感平臺(tái)。該探針利用Aptamer上A堿基的內(nèi)源SERS信號(hào)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，方法快速，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便且選擇性好。同時(shí)引入了MBA為內(nèi)標(biāo)，克服了SERS信號(hào)不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。在優(yōu)化了Aptamer的熱預(yù)處理、AuNPs溶液濃度、Aptamer和MBA在AuNPs上修飾順序，以及探針制備過程中Aptamer和MBA加入量等實(shí)驗(yàn)條件下，以MBA和Aptamer的SERS特征峰的相對(duì)強(qiáng)度隨凝血酶濃度的變化關(guān)系為依據(jù)，實(shí)現(xiàn)了一定濃度范圍(100～2 000 nmol·L-1)內(nèi)凝血酶的定量檢測(cè)。本傳感平臺(tái)有很大的普適性，可檢測(cè)許多其他具有相應(yīng)Aptamer的靶標(biāo)物，即使是無A堿基的Aptamer也可通過自行設(shè)計(jì)鏈長度和組成，在Aptamer中增加一定量的A堿基，構(gòu)建相應(yīng)的檢測(cè)平臺(tái)。