高華山，代紅梅，佟偉霜

（平頂山學(xué)院，河南平頂山 467000）

糖尿病是引起阿司匹林抵抗（AR）最主要的因素。根據(jù)大量臨床治療顯示，糖尿病與AR有著非常密切的關(guān)系，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者出現(xiàn)AR的概率明顯更高[1]。另有研究顯示，在糖尿病患者機(jī)體中血小板活性有顯著升高，導(dǎo)致其出現(xiàn)心血管的發(fā)病率較之普通人群高出了2～4倍[2]。另有報(bào)道表示，在為糖尿病提供阿司匹林干預(yù)的過(guò)程中，與男性相比，女性出現(xiàn)AR的概率明顯更高[3]。本研究在相關(guān)文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，對(duì)2型糖尿?。═2DM）小鼠模型進(jìn)行構(gòu)建，通過(guò)對(duì)雌性與雄性小鼠周期性阿司匹林給藥，對(duì)其與藥效學(xué)相關(guān)的指標(biāo)變化情況進(jìn)行測(cè)定，旨在對(duì)糖尿病狀態(tài)下AR的情況進(jìn)行探討，明確是否存在雌性、雄性差異。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與飼料

購(gòu)入80只小鼠（8周齡，SPF級(jí)，C57BL/6J），其中雌性與雄性小鼠各40只，體重均為20～22 g。將80只小鼠分別關(guān)在10個(gè)籠子內(nèi)，每籠各8只，動(dòng)物在籠內(nèi)自由攝入食物和飲水。高脂飼料（HFD）由筆者根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要執(zhí)行調(diào)配，主要由玉米淀粉、碳酸鈣、復(fù)合維生素、豬油、大豆油和蔗糖等共同組合而成。

1.2 試劑與藥品

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）試劑盒（默沙克生物）、空腹血清胰島素（FINS）、血栓素B2（TXB2）、6酮前列腺素F1a（6-keto-PGF1a）ELISA試劑盒（上海酶研生物科技）；白細(xì)胞介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒（上海康朗生物科技）；鏈脲佐菌素（STZ）、阿司匹林、檸檬酸、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）等（南京化學(xué)試劑）；生理鹽水（平頂山學(xué)院實(shí)驗(yàn)室）等。

1.3 儀器與設(shè)備

酸度計(jì)（HANNA，pH211型）、雅培便攜血糖儀及其一次性血糖試紙、分析天平（AUW，120D）、超純水器（Milli-Q Gradient A10）、酶標(biāo)儀（Powerwave 200）、低溫高速離心機(jī)（德國(guó)）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建模

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[4]，運(yùn)用鏈脲佐菌素和高脂飼料誘導(dǎo)法（HFD/ST）完成T2DM動(dòng)物模型建立。具體建模方法：取健康小鼠，對(duì)其進(jìn)行持續(xù)7d適應(yīng)性喂養(yǎng)，禁食12h后，采用乙醚行麻醉處理，進(jìn)行眼底靜脈叢取血，對(duì)其相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。隨機(jī)選取20只小鼠，為其提供基礎(chǔ)性飼料，并設(shè)定為正常對(duì)照組，另60只小鼠均在取血4d后，禁食12h，對(duì)其體質(zhì)量進(jìn)行稱重，并經(jīng)由腹腔為小鼠注射STZ（正常組注射緩沖鹽溶液）完成高血糖模型的復(fù)制，所有小鼠均在30 min內(nèi)完成所有注射。

1.4.2 分組與給藥

完成腹腔注射后，繼續(xù)為小鼠進(jìn)行3周相應(yīng)飼料的喂養(yǎng)。將20只正常飼料喂養(yǎng)小鼠隨機(jī)分為正常組、正常+阿司匹林組，各組分別有小鼠10只，其中雌性和雄性小鼠各有5只，稱重標(biāo)號(hào)；另60只高脂喂養(yǎng)復(fù)合腹腔注射小劑量STZ的小鼠同樣隨機(jī)分為2型糖尿病模型組（模型組）、模型+阿司匹林組。以灌胃的方式為小鼠提供阿司匹林，給藥劑量為每日13mg/kg（劑量根據(jù)70 kg成年人體表面積換算后得出），持續(xù)干預(yù)10d。

1.5 觀察指標(biāo)

對(duì)各組小鼠的情況進(jìn)行密切觀察，重點(diǎn)對(duì)其體重、狀態(tài)、飲水量、攝食量等情況進(jìn)行觀察。在小鼠尾部進(jìn)行采取，并對(duì)其空腹血糖進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)按照對(duì)其TC、FINS、IL-6、IL-1β水平進(jìn)行測(cè)定，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒要求實(shí)施。取腹主動(dòng)脈血500μL，按照流式細(xì)胞儀對(duì)其血小板CD629表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。取眼眶血0.5ml，按照反射免疫檢測(cè)法對(duì)其血漿TXB2、6-keto-PGF1a進(jìn)行測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Stat View對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，并以運(yùn)用Student’s t-test行組間差異檢驗(yàn)。有顯著差異采取雙尾檢驗(yàn)，P＜0.05即表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠基本情況

模型組小鼠表現(xiàn)出明顯的活動(dòng)遲鈍，精神萎靡不振，飲水量與食物攝入量均有明顯增多，且尿量明顯增加，需每日對(duì)墊料進(jìn)行更換，體重增長(zhǎng)明顯。正常組小鼠精神狀態(tài)較佳，尿量、食物攝入量以及體重均表現(xiàn)為平穩(wěn)增加。在為兩組小組提供阿司匹林干預(yù)后，均未觀察到明顯變化。

2.2 HFD/STZ誘導(dǎo)小鼠的體重、糖脂、胰島素水平變化

正常組與模型組小鼠對(duì)比顯示，兩組FBG、FINS、TG、TC與BW均有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組的體重、糖脂指標(biāo)與胰島素水平與正常組比較均有顯著升高，這表明本次T2DM模型成功，見(jiàn)表1。

2.3 HFD/STZ誘導(dǎo)小鼠的血清炎癥因子變化

正常組與模型組小鼠對(duì)比顯示，兩組IL-6、IL-1β均有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組的IL-6、IL-1β水平與正常組比較均有顯著升高。見(jiàn)表2。

表1 HFD/STZ誘導(dǎo)小鼠的體重、糖脂、胰島素水平變化

表2 HFD/STZ誘導(dǎo)小鼠的血清炎癥因子變化

2.4 阿司匹林對(duì)小鼠血小板CD62P的影響

阿司匹林未干預(yù)與干預(yù)10 d血小板CD62P表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)圖1來(lái)看，模型組雌性小鼠血小板CD62P顯著高于正常組小鼠，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明在2型糖尿病狀態(tài)下會(huì)致使雌性小鼠血小板CD62P活性增強(qiáng)。在為正常組小鼠實(shí)施阿司匹林干預(yù)后，雌性小鼠和雄性小鼠血小板CD62P均表現(xiàn)出下降（P＜0.05），這表明阿司匹林可有效控制血小板CD62P的活性。模型組小鼠在行阿司匹林干預(yù)后，其雄性小鼠的血小板CD62P也呈現(xiàn)為明顯下降（P＜0.05），但雌性小鼠與干預(yù)前比較無(wú)差異（P＞0.05），這表明阿司匹林干預(yù)后雄性小鼠血小板CD62P活性得到控制，而雌性小鼠表現(xiàn)出AR。

2.5 阿司匹林對(duì)小鼠血漿TXB2/6-keto-PGF1a水平的影響

阿司匹林未干預(yù)與干預(yù)10 d血漿TXB2/6-keto-PGF1a表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析見(jiàn)圖2。根據(jù)圖2來(lái)看，正常組雌性與雄性小鼠在行阿司匹林干預(yù)后，其血漿TXB2/6-keto-PGF1a均表現(xiàn)出下降，該結(jié)果與血小板CD62P檢測(cè)結(jié)果一致。模型組小鼠在行阿司匹林干預(yù)后，其雄性小鼠的血漿TXB2/6-keto-PGF1a也呈現(xiàn)為明顯下降（P＜0.05），但雌性小鼠在進(jìn)行阿司匹林干預(yù)后，其表達(dá)出現(xiàn)了血漿TXB2/6-keto-PGF1a明顯升高（P＜0.05）。這表明阿司匹林干預(yù)后可較好地達(dá)到對(duì)雄性小鼠的抗血小板干預(yù)效果，但在雌性小鼠上其藥效學(xué)卻出現(xiàn)了明顯下降，故引起了相反的情況。

圖1 阿司匹林未干預(yù)與干預(yù)10 d血小板CD62P表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析

圖2 阿司匹林未干預(yù)與干預(yù)10 d血漿TXB2/6-keto-PGF1a表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析

3 討論

本研究通過(guò)為小鼠提供小劑量STZ與高脂肪飲食，使得模型組小鼠表現(xiàn)出了明顯的血糖升高、體重增加、血脂升高等糖代謝紊亂現(xiàn)象，同時(shí)其胰島素水平也有顯著增加，形成了胰島素抵抗，這與以往研究報(bào)道[5]所構(gòu)建的模型結(jié)果相同，且也符合T2DM的臨床特征。血小板活化主要是受到前列腺素（PGI2）與血栓素（TXA2）之間比例的影響，其分別來(lái)源于血小板環(huán)氧合酶COX-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2，為此，本研究在對(duì)阿司匹林效應(yīng)的評(píng)價(jià)中選取了TXB2/6-keto-PGF1a比值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。CS62P是血小板后期活化階段非常關(guān)鍵的特異性標(biāo)志物，當(dāng)血小板被激活之后，血小板表面膜與其細(xì)胞質(zhì)中的a顆粒相互融合，從而促使大量CD62P被迅速釋放，使其大量暴露在血小板表面。為此，通過(guò)該項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定能夠充分體現(xiàn)血小板的活化情況。本研究在采取HFD/STA行誘導(dǎo)建模后，模型組的小鼠其血小板表面CD62P表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著增加，特別是雌性小鼠尤其明顯，而通過(guò)對(duì)小鼠實(shí)施阿司匹林用藥干預(yù)后，正常組與模型組雄性小鼠均對(duì)阿司匹林表現(xiàn)出較好的藥效學(xué)效應(yīng)，而雌性小鼠的血小板CD62P與TXB2/6-keto-PGF1a表達(dá)均未出現(xiàn)其應(yīng)用的下降，反而出現(xiàn)了升高，其中TXB2/6-keto-PGF1a表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），該結(jié)果與以往的臨床研究成果一致，與男性相比，女性更易發(fā)生AR[6]。但需要重視的是，在通過(guò)HFD/STA行誘導(dǎo)建模后，模型組的小鼠其血清IL-6、IL-1β水平均高于正常組，研究者表示[7]，糖尿病所表現(xiàn)出慢性炎癥特征，與血管內(nèi)皮COX-2升高密切相關(guān)，這就為下一步AR形成機(jī)制的探索提供了新的思路。