陳天翱，陳封政

（1.四川省樂山第一中學(xué)校，四川樂山 614000；2.樂山師范學(xué)院 化學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000）

西紅花（Crocus sativus L.）為鳶尾科番紅花屬植物的干燥柱頭，主產(chǎn)于印度、伊朗、西班牙和意大利等[1]。西紅花于唐代時(shí)由印度經(jīng)西藏傳入我國，故西紅花又稱為藏紅花、番紅花，目前西紅花在我國江浙一帶有大面積栽培。西紅花藥用歷史悠久，具有活血化瘀、解毒安神、涼血解毒等功效[2]，但西紅花產(chǎn)量極低，有報(bào)道稱10萬株西紅花才能產(chǎn)生1千克柱頭，故西紅花價(jià)格昂貴，有“植物黃金”之稱[3]。西紅花的主要活性成分和特征成分為西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ，《中華人民共和國藥典》（2015年版）以西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的總含量為指標(biāo)成分。梔子是一種廉價(jià)的中藥材，該藥材中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量很高[4]，故一些不法商人就向西紅花提取物或含有西紅花的產(chǎn)品中人為摻雜梔子或從梔子中分離出的西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ來以次充好。為了從西紅花中尋找更特征的成分，對西紅花的成分進(jìn)行了研究，分離得到了一純品化合物，經(jīng)核磁鑒定該化合物為苦藏花素，并進(jìn)行了抑菌活性測試。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西紅花，購自樂山市康發(fā)藥業(yè)有限公司（產(chǎn)地：西藏），產(chǎn)品批號1604407；左氧氟沙星，購自百靈威科技有限公司；菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli），均由樂山師范學(xué)院微生物室提供；培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

干燥箱、培養(yǎng)箱、移液槍、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、真空抽提器、循環(huán)水真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、GeLai制備液相色譜、Waters色譜儀、Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦藏花素的提取與純化

稱取100 g西紅花，用500 mL乙醇室溫浸泡提取6天，過濾；濾渣再次用500 mL乙醇室溫浸泡提取6天，過濾，合并濾液。在50 ℃條件下減壓濃縮濾液至膏狀，用水將膏狀物制成50 mL溶液，先用普通濾紙過濾，濾液再用0.45 μm的濾膜過濾，得到樣品的制備液。將該制備液一次性吸入制備液相色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫：運(yùn)行時(shí)間60 min。0 min時(shí)，乙腈含量為10%，60 min時(shí)，乙腈含量為70%；流速20 mL/min，檢測波長220 nm，按照峰收集洗脫液。經(jīng)過多次制備分離，得到一純度較高組分，然后以分析液相色譜儀檢測該化合物純度。

1.2.2 苦藏花素的結(jié)構(gòu)鑒定

以氘代甲醇為溶劑，用Varian INOVA 400核磁共振譜儀進(jìn)行核磁測試，通過核磁共振氫譜和碳譜圖解析目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.3 苦藏花素抑菌活性的測定

1.2.3.1 菌懸液的制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，分別制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌濃度為107個(gè)/mL的試驗(yàn)菌懸液，備用。

1.2.3.2 抑菌試驗(yàn)

用移液槍精密吸取各種菌懸液0.2 mL放入培養(yǎng)基中，用無菌三角玻璃涂布棒將菌懸液涂抹均勻。將滅菌的濾紙圈（濾紙圈直徑為5 mm）在0.5 mg/mL的樣品中完全浸透，然后將濾紙圈覆蓋在培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈的直徑。陽性對照為左氧氟沙星（0.5 mg/mL）；陰性對照為無菌蒸餾水。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，抑菌圈直徑取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦藏花素的制備

從100 g西紅花中制備分離出一純度較高組分，濃縮后得到化合物25 mg，以分析液相色譜儀檢測該目標(biāo)化合物純度為94%（檢測條件：檢測波長220 nm，流速1 mL/min，洗脫液：乙腈-水，設(shè)定時(shí)間為20 min，0 min時(shí)，乙腈比例為10%，20 min時(shí)，乙腈比例為60%），見圖1。從圖1可以看出，該目標(biāo)化合物中仍含有少量雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的出峰時(shí)間分別為5.42 min、7.98 min和13.44 min，從出峰時(shí)間可以看出，主要雜質(zhì)（出峰時(shí)間分別為5.42 min和7.98 min）的極性比目標(biāo)化合物強(qiáng)，次要雜質(zhì)（出峰時(shí)間為13.44 min）的極性比目標(biāo)化合物弱，三種主要雜質(zhì)的總含量低于6%，單個(gè)雜質(zhì)的含量約為目標(biāo)化合物的2%，故做核磁測試時(shí)，雜質(zhì)不會影響該目標(biāo)化合物的鑒定。

圖1 苦藏花素的HPLC純度

2.2 苦藏花素的鑒定

通過核磁測試得到該化合物的核磁共振氫譜圖（圖2）和碳譜圖（圖3）。通過核磁共振譜可以看出，δH10.08（1H, s）和δC192.4為明顯的醛基信號；δH1.18（3H, s），1.16（3H, s） 與 δC29.1，27.8為碳上角甲基信號，且化學(xué)位移相近，性質(zhì)相似；同樣δH2.10（3H, s）與δC19.2亦為碳上角甲基信號；δC154.3和δC139.5是一組雙鍵碳信號；δC101.3，77.2，77.2，73.9，70.5，69.7，61.5 是一個(gè)六碳糖的信息，其中δC101.3是糖上的端基碳。這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道的苦藏花素的核磁數(shù)據(jù)基本一致。故該化合物鑒定為苦藏花素（picrocrocin），其結(jié)構(gòu)式如圖4，其氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬見表1。

圖2 苦藏花素的核磁共振氫譜

圖3 苦藏花素的核磁共振碳譜

表1 苦藏花素的NMR數(shù)據(jù)

圖4 苦藏花素的結(jié)構(gòu)

2.3 苦藏花素抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

以左氧氟沙星為陽性對照，以無菌蒸餾水為陰性對照，采用抑菌圈法測定化合物的抑菌活性。抑菌圈直徑越大表示化合物的抑菌活性越強(qiáng)。抑菌實(shí)驗(yàn)測量數(shù)據(jù)見表2。

從表2可以看出，苦藏花素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有抑制作用，尤其對枯草芽孢桿菌的抑制作用更強(qiáng)，但活性均弱于陽性對照左氧氟沙星。

表2 苦藏花素的抑菌圈直徑

3 結(jié)論

對西紅花成分進(jìn)行成分分離，得到了純品，通過核磁共振技術(shù)鑒定為苦藏花素，并通過抑菌圈法研究了該化合物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌活性，結(jié)果顯示苦藏花素對三種菌都有抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌活性略強(qiáng)。

西紅花臨床用途很多，用于治療心血管病、心臟病、肝病、癔癥、中風(fēng)、癰腫等疾病?，F(xiàn)代藥理報(bào)道西紅花的生理活性很多，如抗腫瘤、抗氧化和降血脂等[8]。通過對苦藏花素抑菌活性研究，顯示西紅花具有抑菌作用，該研究為擴(kuò)大西紅花的使用范圍奠定了理論基礎(chǔ)。