賀美蓮， 郭常川， 冷佳薇， 張迅杰， 咸瑞卿，鞏麗萍， 石 峰， 姜 瑋

(1．山東大學藥學院，山東濟南250012;2．山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101;3．山東大學化學與化工學院，山東濟南250100)

鹽酸氨溴索，化學名為反式-4-［2-氨基-3，5-二溴芐基)-氨基］環(huán)己醇鹽酸鹽，是常用的祛痰藥，1991年在我國上市［1，2］。鹽酸氨溴索可以溶解痰液，潤滑呼吸道，并促進肺表面活性物質的分泌和纖毛運動，臨床上用于治療支氣管哮喘和慢性支氣管炎［3－5］。有報道［6］表明氨溴索具有葡糖基神經酰胺酶活性和減少細胞中氧化應激標志物的作用，顯示氨溴索可能具有治療帕金森癥的潛力。

現(xiàn)有的鹽酸氨溴索的生物分析方法包括液相色譜法［7，8］、毛細管電泳法［9］和液相色譜-串聯(lián)質譜法［10－18］等。生物樣品分析具有取樣量少、分析物濃度低以及含內源性物質干擾的特點［19］。因此，液相色譜-串聯(lián)質譜法以其選擇性好、靈敏度與準確度高、前處理方法簡單的優(yōu)勢成為最為常用的分析鹽酸氨溴索生物樣品的方法。但是現(xiàn)有的方法仍存樣品前處理過程復雜［10－12］、檢測時間長［13，14］、血漿用量大［11，13，15－17］等問題。例如王國才等［15］采用液相色譜-質譜法測定氨溴索的血藥濃度，血漿用量為100 μL，對臨床采血量要求較高，降低了臨床依從性。因此，有必要開發(fā)一種血漿用量少、快速、靈敏且前處理簡單的新方法，以滿足人血漿中鹽酸氨溴索定量分析的需求。

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UHPLC-MS/MS)測定人血漿中鹽酸氨溴索含量的方法。該方法快速、靈敏，血漿用量少。將該法用于6名健康受試者的生物等效性預試驗，可為正式生物等效性試驗提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Triple Quad 5500超高效液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司)，配有Analyst 1.6.2積分軟件;3K15臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司);MDF-U5412N醫(yī)用低溫箱(日本松下公司);Milli-Q Advantage A10超純水器(美國 Millipore公司)。

鹽酸氨溴索標準品(純度＞99.0%，中國食品藥品檢定研究院);鹽酸氨溴索-d5標準品(純度100%，加拿大 TLC 公司);甲醇、甲酸、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(色譜純，德國默克公司)。受試制劑:鹽酸氨溴索分散片(規(guī)格:30 mg，批號:1724284，煙臺東誠大洋制藥有限公司);參比制劑:鹽酸氨溴索片(商品名Surbronc Expectorant，規(guī)格:30 mg，批 號:161853，德 國 Boehringer Ingelheim制藥有限公司)。

1．2 標準溶液的配制

準確稱取鹽酸氨溴索標準品10.50 mg，用10.48 mL DMF溶解，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準品儲備液，于－20℃冰箱中保存。準確移取適量標準品儲備液，用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋并配制成適當濃度的標準工作液。準確稱取鹽酸氨溴索-d5標準品 10.17 mg，用 10.17 mL DMF溶解，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的內標儲備液，再用50%(v/v)甲醇水稀釋至25 ng/mL，作為內標工作溶液，于－20℃冰箱中保存。

1．3 樣品前處理

精密移取50 μL血漿樣品，加入50 μL內標工作溶液后，加入400 μL甲醇沉淀蛋白質，渦旋5 min，于4℃以14 000 r/min離心10 min，取上清液，待分析。

1．4 對照樣品的制備

對照1:取空白血漿380 μL，分別加入鹽酸氨溴索標準溶液 20 μL，配制成含4.0、150.0和 300.0 ng/mL鹽酸氨溴索的血漿樣品，按1.3節(jié)描述處理;對照2:將空白血漿按1.3節(jié)描述處理后，配制含鹽酸氨溴索4.0、150.0和300.0 ng/mL的基質樣品;對照3:含4.0、150.0和300.0 ng/mL鹽酸氨溴索的50%(v/v)甲醇水溶液。

1．5 分析條件

1．5．1 色譜條件

色譜柱:XBridge BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，2.5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液;流速:0.4 mL/min;進樣量:2 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1．5．2 質譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源，正離子模式;離子源溫度:500℃;檢測模式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;離子化電壓:5 500 V;入口電壓(EP):10 V;碰撞室出口電壓(CXP):19 V。鹽酸氨溴索:監(jiān)測離子對，379.0/263.8;碰撞能量(CE)，25 V;去簇電壓(DP)，70 V。鹽酸氨溴索-d5:監(jiān)測離子對，m/z 384.0/263.8;CE，30 V;DP，110 V。

1．6 臨床試驗方案

篩選6名健康成年受試者，身體質量指數(shù)(BMI)為19～26 kg/m2，無病史，且體格檢查、心電圖、胸片、實驗室項目及其他相關檢查均正?；驘o臨床意義的異常。受試者均自愿參加本次臨床試驗，理解研究程序且已簽署知情同意書。

采用單劑量雙周期雙順序交叉試驗設計，6名受試者隨機分為兩組。第Ⅰ周期，3名受試者進食高熱量、高脂餐后，口服受試制劑鹽酸氨溴索分散片30 mg，另3名受試者進食高熱量、高脂餐后，口服參比制劑鹽酸氨溴索片30 mg，7天后交叉給藥進行第Ⅱ周期研究。

兩周期試驗分別于給藥前(0 h)和給藥后0.33、0.67、1.0、1.33、1.67、2.0、2.33、2.67、3.0、4.0、5.0、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0 和 48.0 h 采集靜脈全血4 mL，置于預冷的乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，于4℃以3 000 r/min離心10 min，所得血漿樣品儲存于－60℃超低溫冰箱中，用于測定血漿中鹽酸氨溴索的含量。

1．7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

使用DAS 2.0軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)并計算藥動學參數(shù)，使用Winonlin 6.2軟件進行統(tǒng)計分析。主要藥動學參數(shù)經對數(shù)轉換后以多因素方差分析(ANOVA)進行顯著性檢驗，然后用雙向單側t檢驗和計算90%置信區(qū)間的統(tǒng)計方法評價和判斷受試制劑和參比制劑之間的生物等效性。

2 結果與討論

2．1 方法學考察

2．1．1 標準曲線

取空白血漿190 μL，加入10 μL不同濃度的鹽酸氨溴索標準溶液，使樣品中鹽酸氨溴索的質量濃度分別為 2.0、6.0、20.0、50.0、100.0、200.0、320.0和400.0 ng/mL，按1.3節(jié)所述進行樣品前處理，經UHPLC-MS/MS方法測定。采用Analyst軟件自動積分，回歸方程以鹽酸氨溴索與鹽酸氨溴索-d5的色譜峰面積之比為縱坐標(y)，以血漿中分析物的質量濃度為橫坐標(x，ng/mL)，采用加權(W=1/x2)最小二乘法，得到的標準曲線為y=0.049 4x+0.007(n=8)，其相關系數(shù)(r)為0.998，相對標準偏差(RSD)均在規(guī)定范圍之內，說明鹽酸氨溴索在2.0～400.0 ng/mL范圍內線性良好，據(jù)此計算得到的藥物濃度準確可靠。

定量限為標準曲線的最低點，并滿足信噪比S/N＞10。圖1a為鹽酸氨溴索在定量限(2 ng/mL)水平下的選擇離子色譜圖，鹽酸氨溴索的保留時間為1.30 min，鹽酸氨溴索-d5的保留時間為1.29 min，并得到較好的峰形與響應值。圖1b為空白血漿樣品的色譜圖，并與圖1a進行比較，發(fā)現(xiàn)空白血漿樣品的色譜圖中沒有干擾峰出現(xiàn)，說明方法對分析物及內標的定量沒有影響。圖1c為受試者服用氨溴索4 h后的血漿樣品提取離子色譜圖，結果表明該方法在用于實際血漿樣品測定時，保留時間沒有發(fā)生漂移。

2．1．2 準確度與精密度

配制含鹽酸氨溴索定量限(2.0 ng/mL)和低、中、高(4.0、150.0、300.0 ng/mL)水平的質控樣品各6份，按1.3節(jié)描述進行前處理并測定了3個分析批，考察批內、批間準確度和精密度。結果顯示，4個水平的質控樣品批內準確度為97.1%～108.7%，批間準確度為99.0%～106.9%;批內精密度為1.0%～5.6%，批間精密度為3.7%～5.1%(見表2)。表明該方法準確度和精密度均良好。

圖1 (a)加標(2 ng/mL)血漿樣品、(b)空白血漿樣品和(c)受試者服用氨溴索4 h后血漿樣品的提取離子色譜圖Fig．1 Extract ion chromatograms of(a)a spiked plasma sample(2 ng/mL)，(b)a blank plasma sample and(c)a plasma sample after administration of ambroxol hydrochloride tablets for 4 h

表2 鹽酸氨溴索在不同加標水平下的準確度與精密度Table 2 Accuracies and precisions of the ambroxol hydrochloride under different spiked levels

2．1．3 選擇性、基質效應和提取回收率

選擇6批來自不同受試者的空白基質，分別配制成空白基質樣品以及定量限水平的樣品。其中，空白基質樣品中干擾組分的響應強度均低于分析物定量限響應強度的3%，并低于內標響應強度的1%。說明該方法具有較好的選擇性，能夠區(qū)分分析物和內標與基質中的干擾組分。

基質效應的考察通過計算基質因子來評價。基質因子為基質存在下目標物的響應峰面積與純溶液中目標物響應峰面積的比值，即對照2樣品與對照3樣品中鹽酸氨溴索峰的面積之比。計算得到分析物的基質因子為95.4%，說明該方法的基質效應不影響鹽酸氨溴索的定量分析。

實驗考察分析物在低、中、高3個水平下的提取回收率，結果分別為98.0%、98.3%和99.3%，內標的提取回收率為97.1%。說明該方法回收率較高，結果較為準確。

2．1．4 穩(wěn)定性

考察了不同條件下放置的樣品中氨溴索的含量，包括儲備液和工作溶液室溫放置12 h、血漿樣本5次凍融循環(huán)、處理過的樣品在室溫放置6 h及在自動進樣器中放置24 h，并計算其與新鮮制備樣品中氨溴索含量的比值，分別為101.2%、106.3%、98.2%、93.6%和103.8%，表明鹽酸氨溴索在上述條件下均能保持穩(wěn)定。

2．2 血漿中的鹽酸氨溴索的測定

采用本文方法測定6名受試者口服受試制劑及參比制劑后的血藥濃度，以時間為橫坐標、測定的血藥濃度為縱坐標，分別繪制受試制劑及參比制劑的鹽酸氨溴索血藥濃度-時間曲線(見圖2)。

圖2 受試者單劑量口服鹽酸氨溴索片的血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig．2 Plasma concentration-time curves of ambroxol hydrochloride tablets in subjects after a single oral dose(n=6)

用DAS 2.0軟件計算兩種鹽酸氨溴索片劑的藥動學參數(shù)，結果見表3。由血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0－t、AUC0－∞)計算出每個受試者的相對生物利用度，結果受試制劑對參比制劑的相對生物利用度為(102.3±14.8)%。將 AUC0－t、AUC0－∞和最大血藥濃度經對數(shù)轉換后，采用雙向單側t檢驗及90%置信區(qū)間法評價兩種片劑的生物等效性。受試制劑的 AUC0－t、AUC0－∞和 Cmax的 90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應參數(shù)的91.2%～115.5%、91.1%～115.6%、88.1%～116.9%，均在80.0%～125.0%范圍內。結果表明，本研究中鹽酸氨溴索受試制劑和參比制劑在人體內的吸收速度和程度無顯著性差異，具有生物等效性。

表3 受試制劑與參比制劑的主要藥動學參數(shù)比較(n=6)Table 3 Comparison of main pharmacokinetic parameters of test preparation with reference preparation(n=6)

3 結論

本文建立了UHPLC-MS/MS測定人血漿中鹽酸氨溴索含量的方法，并應用于人體生物等效性預試驗。該方法具有靈敏度高、選擇性好、基質效應小的優(yōu)點。在試驗過程中，受試者均未有臨床意義的藥物不良反應出現(xiàn)。本試驗為鹽酸氨溴索分散片的生物等效性研究提供了數(shù)據(jù)參考，為正式試驗奠定了基礎。