張澤芳 袁 薇 徐 明 易 韜 張善端 李富友＊，

(1復(fù)旦大學先進照明技術(shù)教育部工程研究中心，上海 200433)

(2復(fù)旦大學化學系，上海 200433)

(3復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200040)

0 引 言

目前，光學成像具有無創(chuàng)性、實時、高分辨率的特點，在疾病的早期診斷和具有重要意義，其中近紅外(near-infrared，NIR)成像其發(fā)射波長位于700～1 000 nm，在該范圍內(nèi)生物組織自發(fā)熒光較少，吸收低，近年來成為生物成像研究的熱點。NIR染料應(yīng)用于生物成像可最大限度的降低背景干擾，增加組織穿透深度[1-2]。如小分子染料吲哚菁綠(indocyanine Lreen，ICG)作為造影劑已被美國食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and DruL Administration，F(xiàn)DA)批準應(yīng)用于臨床手術(shù)導航和淋巴結(jié)的指示。但大部分NIR染料發(fā)光效率底、水溶性差、在生物體內(nèi)造影時間短[3]。因此將納米材料對NIR染料進行包裹，有利于克服上述局限性，拓展其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[4-5]。

近年來，納米材料功能化后被用作診斷和治療的工具，在疾病的診療領(lǐng)域被廣泛關(guān)注[6-8]。比如基于納米結(jié)構(gòu)的造影劑被大量開發(fā)，用于對病理結(jié)構(gòu)進行高信噪比的成像[9-10]。其中二氧化硅(SiO2)納米顆粒作為一種生物相容性好的非金屬無機材料，尤其是介孔SiO2納米材料具有較大的孔容和比表面積，在酶固定、藥物遞送、生物成像等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景[11-13]。目前，熒光SiO2納米材料的常用合成方法是先制備介孔SiO2粒子，再將熒光染料吸附到SiO2的介孔孔道中[14-15]。該方法存在熒光染料容易從孔道中脫附的弊端，而且所制備的熒光SiO2納米材料因表面無特殊功能化，容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticulo-endothelial system，RES)識別，并在肝臟、脾臟、肺等器官中長期蓄積，造成機體的長期毒性[16]。

本文利用三嵌段共聚物(Pluronic F108)和氧化硅前驅(qū)體合成單體，后通過自組裝，獲得內(nèi)部中空的氧化硅聚合物雜化納米體系[17-18]。由于嵌段共聚物為兩親性的PEO132-PPO50-PEO132，聚環(huán)氧乙烷(poly(ethylene oxide)，PEO)鏈可伸展于納米顆粒表面，形成配體，與后修飾的PEG配體相比，合成方法更簡單，不受修飾位點限制，密度更高，能有效阻止RES系統(tǒng)的識別和截獲，有助于氧化硅納米材料獲得更長的循環(huán)時間。聚環(huán)氧丙烷(poly(propylene oxide)，PPO)與氧化硅前驅(qū)體共價連接，組裝時形成疏水空腔，疏水染料或藥物與PPO通過疏水-疏水相互作用，形成較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，不易從空腔中逃逸，功能化的雜化氧化硅納米體系得以構(gòu)建[19]。在此我們使用易揮發(fā)的溶劑環(huán)己烷作為擴孔劑，溫和條件下可被完全除去，以獲得更大的中空結(jié)構(gòu)，負載更多疏水染料或藥物。我們進一步合成了一種發(fā)光效率高的NIR疏水染料M507，通過疏水-疏水作用簡單、快捷地將M507負載在氧化硅-共聚物雜化納米顆粒內(nèi)部空腔中，構(gòu)建了小尺寸的近紅外納米探針(圖1)，并在活體層次開展尾靜脈注射后的動物整體成像實驗和足墊注射后的前哨淋巴結(jié)成像實驗。

圖1 熒光復(fù)合納米材料M507@SNP的構(gòu)建過程和活體成像示意圖FiL.1 Schematic illustration of the synthetic strateLy of the fluorescent nanocomposite M507@SNPand its application in animal imaLinL

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N-聚丙二醇與環(huán)氧乙烷嵌段共聚物(Pluronic F108)、四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS)、二乙氧基二甲基硅烷(dimethyldimethoxysilane，DEDMS)，鹽酸(HCl)，胺丙基三乙氧基硅烷(aminopropyl triethoxysilane，APES)，均購買自SiLma-Aldrich化學試劑公司。丙二醛雙苯亞胺單鹽酸鹽(malo-naldehyde bis(phenylimine)monohydrochlride)購買自百靈威科技有限公司。以上藥品均為分析純，使用過程中不需要進一步提純。實驗用水均為去離子水。碘化1-乙基-2，3，3-三甲基苯并吲哚鹽和 1-乙基-4-甲基喹啉碘化物照文獻[20]的方法合成。

人宮頸癌細胞HeLa細胞購買自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。4周大的雌性Balb/c裸鼠購買自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物實驗流程均符合動物管理與使用委員會的規(guī)則標準。

利用透射電子顯微鏡JEOLJEM-2010F(TEM，200 kV)表征納米材料的尺寸和形貌，將納米材料分散在水中，取一滴于銅網(wǎng)上，自然晾干后進行表征。

紫外吸收光譜于PTI公司的QM40穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀上測試。熒光發(fā)射光譜于EdinburLh公司的LFS920熒光光譜儀上測試。粒徑分布于Malvern公司的納米粒度-Zeta電位分析儀上進行測試。絕對量子效率于Hamamatsu instrument公司的C13532-12 Quantaurus-QY plus測量系統(tǒng)進行測試。

1.2 近紅外染料M507的合成和表征

染料M507按照圖2所示的路線合成。在50 mL 三口燒瓶中，分別加入 1.3 L 1-乙基-2，3，3-三甲基苯并吲哚碘化物1.0 L丙二醛雙苯亞胺單鹽酸鹽(物質(zhì)的量之比為1∶1.1)，然后加入20 mL醋酸酐(Ac2O)，1 mL 醋酸(AcOH)，0.5 L 醋酸鉀(AcOK)，在氮氣氛圍下，于90℃持續(xù)攪拌反應(yīng)2 h，然后再加入0.9 L 1-乙基-4-甲基喹啉碘化物繼續(xù)反應(yīng)2 h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后加入到200 mL水中，攪拌并緩慢加入碳酸氫鈉至無氣泡產(chǎn)生。使用二氯甲烷萃取后加入無水硫酸鈉干燥，旋干除去溶劑后，得到的粉末以二氯甲烷和甲醇為洗脫液 (二氯甲烷與甲醇體積之比為10∶1)，在硅膠柱上分離提純，得到目標染料M507。染料的結(jié)構(gòu)通過質(zhì)譜與核磁進行確認，并計算產(chǎn)率為52%。

圖2 染料M507的合成路線示意圖FiL.2 Synthetic route of NIR dye M507

1.3 SNP雜化納米材料的合成

嵌段共聚物F108與二氯甲烷(質(zhì)量之比為2∶1)分散于30 mL的2.0 mol·L-1鹽酸溶液中，充分攪拌30 min后，得到透明溶液；再加入1.0 mL四乙氧基硅烷(TEOS)，15 min后再加入二乙氧基二甲基硅烷(DEDMS)，同時加入一定量的環(huán)己烷作為擴孔劑，持續(xù)攪拌3 h。充分透析去除雜質(zhì)，然后在50℃下旋蒸去除二氯甲烷，將所得的二氧化硅-聚合物雜化納米復(fù)合材料(SNP)分散在水中保存。

1.4 復(fù)合納米探針M507@SNP的制備

將1.5 mL的M507染料溶于50μL二氯甲烷中，將此溶液注入SNP水溶液(濃度為10 mL·mL-1)中，超聲使其分散均勻；然后在50℃下，旋蒸去除二氯甲烷；產(chǎn)物在水中分散，透析洗去游離的M507染料，得到納米復(fù)合材料M507@SNP。

1.5 細胞毒性評估

根據(jù)文獻[21]，在體積百分數(shù)為5%CO2和95%空氣氛中，37℃下孵育12 h。待HeLa細胞貼壁后，用 DMEM(Dulbecco′s Modified EaLle Medium)培養(yǎng)液稀釋不同濃度的M507@SNP，培養(yǎng)箱中孵育24 h。分別在每個孔里加入20μL濃度為5 mL·mL-1的 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)溶液，將96孔板繼續(xù)孵育 4 h，在每個孔里加入二甲亞砜(DMSO)100μL，在培養(yǎng)箱中放置20 min后，用酶標儀測試96孔板中每個孔在490 nm處的吸收光強度(即OD490值)的吸收光強度。用以下公式計算細胞存活率：

其中 Cell viability 為細胞存活率，ODSample、ODBlank和ODControl分別為樣品的OD490平均值、空白的OD490平均值和對照的OD490平均值。

1.6 裸尾靜脈注射M507@SNP的活體成像實驗

向健康4周齡雌性Balb/c裸鼠尾靜脈注射0.2 mL的 M507@SNP(1.0 mL·mL-1)溶液。 注射24 h后對小鼠進行麻醉，在小動物活體成像系統(tǒng)中進行成像[22]，激發(fā)波長為 730 nm，功率密度為40 mW·cm-2，收集波長為(800±12)nm。通過斷頸處死小鼠后，剖開其腹部，暴露主要器官，再次進行熒光成像。

1.7 M 507@SNP用于前哨淋巴結(jié)成像實驗

向健康4周齡雌性Balb/c裸鼠的右側(cè)足墊注射0.02 mL的M507@SNP(1.0 mL·mL-1)溶液。注射24 h后對小鼠進行麻醉，在小動物活體成像系統(tǒng)中成像，激發(fā)波長為730 nm，功率密度為40 mW·cm-2，收集波長為(800±12)nm。通過斷頸處死小鼠后，剖開其腿部皮膚，暴露前哨淋巴結(jié)，再次進行熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氧化硅納米復(fù)合材料SNP的表征

合成的二氧化硅-聚合物雜化納米復(fù)合材料SNP通過透射電鏡對其形貌和粒徑進行表征。圖3a為由三嵌段共聚物F108和氧化硅前驅(qū)體自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)，環(huán)己烷的加入可作為擴孔劑得到空心結(jié)構(gòu)。SNP為粒徑均一的單分散空心納米球狀顆粒，其直徑約為31 nm。動態(tài)光散射(DLS)測試表明該粒子約為41 nm，如圖3b所示。所制備的納米材料SNP具有空心結(jié)構(gòu)，內(nèi)部空腔直徑約為10 nm，為后續(xù)負載有機染料M507提供了可能性。

圖3 納米材料SNP的TEM照片(a)和DLS粒徑分布圖(b)FiL.3 TEM imaLe(a)and size distribution(b)of the SNP nanoparticle

2.2 近紅外染料M507的結(jié)構(gòu)和發(fā)光性質(zhì)

基于先前的工作[23]，我們以Cy5.5為基礎(chǔ)，將苯并吲哚替換為喹啉來設(shè)計近紅外染料分子，合成了喹啉-苯并吲哚結(jié)構(gòu)的M507。我們使用質(zhì)譜和核磁對M507的結(jié)構(gòu)進行了確認，如圖4所示，M507對應(yīng)的最強峰位置在445.190 8，圖5的1H NMR譜圖都能很好地對應(yīng)解釋，證明了產(chǎn)物的純度。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ9.45(d，J=6.6 Hz，1H)，8.40(d，J=8.3 Hz，1H)，8.13(d，J=8.4 Hz，2H)，7.95～7.84(m，5H)，7.72(t，J=7.4 Hz，1H)，7.58(t，J=7.0 Hz，1H)，7.57(dd，J=14.2，7.1 Hz，1H)，7.44～7.33(m，1H)，7.19(d，J=8.7 Hz，1H)，7.00(d，J=13.9 Hz，1H)，6.50(t，J=12.3 Hz，1H)，5.77(d，J=12.9 Hz，1H)，4.93～4.81(m，2H)，3.99(s，2H)，1.71(t，J=7.1 Hz，3H)，1.60(s，6H)，1.42(s，3H)。

圖4 M507的MALDI-TOF譜圖FiL.4 MALDI-TOF spectrum of M507

圖5 M507的1H NMR譜圖FiL.5 1H NMR spectrum of M507

我們考察了M507染料的吸收性質(zhì)和熒光性質(zhì)。圖6給出了M507在二氯甲烷中的紫外可見吸收與熒光發(fā)射光譜。其最大吸收峰位于738 nm，其發(fā)射峰位于820 nm。相比于對稱的染料Cy5，用喹啉鹽替代一個苯并吲哚鹽后，其最大吸收比Cy5(λabs=678 nm)紅移了60 nm，相應(yīng)地，發(fā)射峰紅移120 nm。M507的光譜發(fā)生明顯的紅移，比FDA批準容許臨床使用的染料ICG的發(fā)射波長更長，為后續(xù)納米探針的構(gòu)建和生物成像實驗的開展提供了新的思路。而且，通過絕對量子效率測量系統(tǒng)測出M507在DMSO中的絕對量子效率高達10.1%。經(jīng)過比爾-朗伯定律計算得到M507吸收的摩爾消光系數(shù)為 8×104L·mol-1·cm-1。

圖6 染料M507在二氯甲烷中的紫外-可見吸收與熒光發(fā)射光譜FiL.6 Absorption spectrum and emission spectrum of the dye M507 in dichloromethane

圖7 M507@SNP的紫外-可見吸收光譜隨730 nm激光光照時間的變化圖FiL.7 ChanLe in absorption spectra of the M507@SNP solution under illumination of 730 nm laser with different times

2.3 近紅外納米材料M507@SNP的發(fā)光穩(wěn)定性研究

成像探針的發(fā)光穩(wěn)定性對其能否在活體層次進行長時間的成像起著決定性作用。我們通過紫外吸收光譜對構(gòu)建的近紅外納米材料M507@SNP的光穩(wěn)定進行監(jiān)測。圖7給出了M507@SNP在比較苛刻的條件 (較高的光功率密度：730 nm激光，300 mW·cm-2；無氮氣保護)下的連續(xù)光照(30 min)時的光穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在30 min的連續(xù)光照下，染料的吸光度僅下降約20%，表明即使在苛刻的實驗條件下，M507@SNP仍顯示了良好的光穩(wěn)定性。由于每次生物成像時激光照射時間較短(＜0.5 min)，因此，激光照射造成的光漂白影響(＜0.4%)幾乎可忽略不計。

2.4 M 507@SNP的細胞安全性評估

作為熒光成像探針，必須評估M507@SNP自身的細胞安全性。我們利用MTT毒性分析法，測試了不同濃度的M507@SNP對HeLa細胞的生理毒性。如圖8所示，當M507@SNP濃度高達1.0 mL·mL-1時，細胞存活率仍能保持在80%以上，表明納米探針M507@SNP具有良好的生物相容性，可用于進一步活體實驗。

圖8 通過MTT測試確定M507@SNP(200～1 000μL·mL-1)的細胞增殖影響，孵育溫度為37℃，孵育時間為24 hFiL.8 Cell viability(%)estimated by MTT proliferation tests versus different incubation concentrations of M507@SNP(200～1 000 μL·mL-1)at 37 ℃ for 24 h

2.5 M 507@SNP用于生物成像實驗

在活體層次上，我們開展了納米探針M507@SNP的小鼠尾靜脈注射成像實驗，并利用M507的近紅外熒光信號((800±12)nm)對動物體內(nèi)的納米探針進行成像跟蹤。圖9給出了納米探針M507@SNP注射24 h后進行的成像實驗結(jié)果，從圖9可知，組織的自發(fā)熒光對熒光成像沒有任何影響；即使在未解剖的條件下，肝臟和脾臟區(qū)域均顯現(xiàn)出強烈的熒光信號。解剖后肝臟和脾臟處的熒光信號更明顯，且輪廓清晰，這是由于2個器官含有大量巨噬細胞，為網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的主要器官，因此納米探針會在肝臟和脾臟處富集。

為了進一步驗證M507@SNP在活體層次對前哨淋巴結(jié)造影的效果，我們在小鼠右側(cè)足墊注射了納米探針M507@SNP，并在注射后24 h進行活體成像。如圖10所示，引流的前哨淋巴結(jié)顯示強烈的熒光信號，淋巴結(jié)輪廓清晰完整，信噪比高。上述的活體成像結(jié)果表明，負載了近紅外染料的氧化硅-聚合物雜化納米材料M507@SNP能夠在活體層次實現(xiàn)高信噪比的器官和淋巴結(jié)成像。

圖9 經(jīng)尾靜脈注射M507@SNP后24 h的動物整體熒光成像FiL.9 Whole-body bioimaLinLof the mouse injected intravenously with M507@SNPsolution

圖10 小鼠右側(cè)足墊注射M507@SNP后24 h時的前哨淋巴結(jié)成像FiL.10 In vivo lymphatic node fluorescence imaLinLof the paw of the nude mouse of injected with M507@SNPsolution under illumination at 730 nm

3 結(jié) 論

本文通過引入4-喹啉鹽作為受體，合成了發(fā)光效率較高、波長更長、穩(wěn)定性較好的近紅外有機染料M507，通過將三嵌段共聚物F108和氧化硅的前驅(qū)體連接形成單體，采用自組裝的方法，形成中空結(jié)構(gòu)的氧化硅納米球，加入疏水染料M507，成功構(gòu)建了近紅外熒光納米探針。由于嵌段共聚物兩親性的性質(zhì)，親水段向外保證納米探針在水相中的分散性，疏水段向內(nèi)形成空心結(jié)構(gòu)，并與負載的疏水染料經(jīng)過疏水-疏水相互作用，形成較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，避免M507的逃逸，并實現(xiàn)了活體層次的器官呈現(xiàn)和前哨淋巴結(jié)成像。所制備的納米探針中染料M507最大發(fā)射峰位于近紅外波段820 nm，比傳統(tǒng)染料Cy5的發(fā)射波長紅移了120 nm，在DMSO中的絕對量子效率高達10.1%，為構(gòu)建長波長的近紅外熒光染料提供了新的思路。而且，該熒光納米探針在苛刻條件下表現(xiàn)出較強的光穩(wěn)定性，可用于小動物的整體熒光成像和前哨淋巴結(jié)成像，有望在疾病診斷領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。