周雪 ，陳婷婷 ，李婉蓉 ，劉學(xué) ，吳林菁 ，張嫩玲

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)中藥藥劑學(xué)教研室（貴州省特色藥用植物資源高效利用工程中心，貴陽(yáng)市-貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州省普通高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），藥學(xué)院，貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴安 550025）

（2.省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴州醫(yī)科大學(xué)），貴州貴陽(yáng) 550014）

水果是百姓餐桌上每天的必備食品，與我們的生活息息相關(guān)。農(nóng)藥是農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中必不可少的原料，但是，近些年由于使用者普遍缺乏科學(xué)使用農(nóng)藥的知識(shí)，片面追求產(chǎn)量或延長(zhǎng)保存期限，造成目前市場(chǎng)上流通的水果都不同程度地存在農(nóng)藥殘留問(wèn)題，對(duì)人體的健康造成一定危害。

目前，農(nóng)殘的檢測(cè)方法主要有色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，特別是多組分農(nóng)藥殘留的定量檢測(cè)及篩查多集中于色譜串聯(lián)單極質(zhì)譜（MS）定量、色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（MS/MS）定量及飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS）篩查等方式[1～4]，而其中的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)既具有氣相色譜的高分離效能，又利用了質(zhì)譜準(zhǔn)確鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，特別是應(yīng)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）監(jiān)測(cè)，它能有效的消除雜質(zhì)干擾，提高靈敏度，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)中[5]，但截止到目前水果中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中還未利用MRM模式進(jìn)行定量，大多數(shù)定量模式還是要依靠單離子模式（SIM）檢測(cè)。所以在SIM采集模式下，要想降低雜質(zhì)的離子串?dāng)_問(wèn)題，那么前處理中的凈化階段就顯得非常重要[6]。通常水果基質(zhì)的凈化方式主要以分散固相萃取(MSPD)法和固相萃?。⊿PE）法居多[7,8]，雖然MSPD法操作簡(jiǎn)單，快捷，特別適合批量處理。但是作者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MSPD法凈化效果不如SPE法對(duì)雜質(zhì)的凈化更徹底，且相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中多數(shù)是利用SPE凈化。目前我國(guó)頒布的多組分農(nóng)殘檢測(cè)的國(guó)標(biāo)及行標(biāo)主要有 NY/T 761-2008、GB/T 5009.218-2008及GB 23200.8-2016等，NY/T 761-2008主要是利用氣相色譜法對(duì)蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定，但氣相色譜的靈敏度低，且僅靠保留時(shí)間定性，而蔬菜水果基質(zhì)復(fù)雜，當(dāng)前處理凈化不當(dāng)容易導(dǎo)致雜質(zhì)干擾嚴(yán)重從而發(fā)生錯(cuò)判。GB/T 5009.218-2008為水果及蔬菜中多種農(nóng)藥殘留量的測(cè)定，該法前處理步驟繁瑣，不僅需要凝膠凈化，還需要旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行多次濃縮，耗時(shí)較長(zhǎng)。所以本研究在參照相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較常用的3種固相萃取柱的凈化效果，選擇出可靠的凈化柱，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定以無(wú)籽提為代表的水果中典型的36種有機(jī)氯、菊酯類農(nóng)藥殘留，本方法與相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，操作更加簡(jiǎn)單[9]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿意，可對(duì)仁果類及小型攀緣類水果中的多組分農(nóng)藥殘留進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

布魯克Scion-TQ三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)BRUKER公司；MiLL-Q去離子水發(fā)生器，美國(guó)Millipore公司；T10高速均質(zhì)儀，德國(guó)IKA公司；高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HGC-36A氮吹儀。

7種菊酯混標(biāo)，1000 μg/mL，美國(guó)O2Si公司；其余29種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；無(wú)水Na2SO4，NaCl，優(yōu)級(jí)純，天津科密歐試劑公司；甲醇、乙腈、丙酮(色譜純)，美國(guó)TEDIA公司；Carb/NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)，杭州富?？萍挤?wù)有限公司；Cleanert PC/NH2固相萃取柱(1000 mg/6 mL)，天津博納艾杰爾公司；Pro Elut TPC固相萃取柱(6 mL)，迪馬公司；蘋果、梨、無(wú)籽提購(gòu)于貴陽(yáng)超市。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制

分別稱取36種農(nóng)藥(23種有機(jī)氯農(nóng)藥及13種菊酯農(nóng)藥)標(biāo)準(zhǔn)溶液用丙酮溶解并定容至10 mL，配置成單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后吸取不同體積的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻后配置成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-4 ℃保存，待用。

1.2.2 樣品制備

切取水果試樣(梨、蘋果、提子)的食用部分放入食品加工機(jī)內(nèi)攪碎勻漿，過(guò)濾，稱取20 g水果濾液試樣于50 mL離心管中，加入2×20 mL乙腈，用均質(zhì)器在15000 r/min勻漿提取1 min，加入5 g NaCl，再勻漿提取1 min，將離心管放入離心機(jī)，在10000 r/min冷凍離心5 min，取上清液全部轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，濃縮至1 mL左右，待凈化。在Cleanert PC/NH2柱中加入約1 cm高無(wú)水硫酸鈉，加樣前先用5 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)預(yù)洗柱，當(dāng)液面到達(dá)硫酸鈉的頂部時(shí)，迅速將樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化柱上，再每次用4 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)分三次洗滌樣液瓶，并將洗滌液移入柱中。收集洗脫液氮吹至近干，加入1 mL正己烷混勻后，用于氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：Agilent DB-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30×0.25 mm×0.25 μm)，載氣：氦氣，純度≥99.999%；CID氣：氬氣，分流模式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度：250 ℃，電離模式：電子轟擊離子化(EI)，電離能量：70 eV，分析模式：SIM，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：280 ℃，恒線速度：44 cm/s，進(jìn)樣量：1.0 μL。程序升溫條件：起始溫度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至240 ℃保持4 min，再以10 ℃/min升至280 ℃保持4 min，共40 min。溶劑延遲14.0 min。

表1 36種農(nóng)藥保留時(shí)間及質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Retention times and GC/MS conditions of the 36 Pesticide

31 Cypermethrin（氯氰菊酯）35.57 35.84 35.85 35.86 C22H19Cl2NO3 832.59 52315-07-8 15 181 152 180 -32 Flucythrinate(氟氰戊菊酯) 35.82 36.21 C26H23F2NO4 451.48 70124-77-5 15 163 206 226 199 33 Silafluofen(氟硅菊酯) 36.34 C25H29FO2Si 408.20 105024-66-6 100 258 287 286 -34 Fenvalerate(氰戊菊酯) 36.96 37.28 C25H22ClNO3 419.90 51630-58-1 15 225 161 181 419 35 Tau-fluvalinate(氟胺氰菊酯) 37.20 37.31 C26H22ClF3N2O3 502.10 102581-06-9 100 250 252 181 208 36 Deltamethrin(溴氰菊酯) 38.02 C22H19Br2NO3 505.24 52918-63-5 30 181 251 172 174

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑體積及提取次數(shù)優(yōu)化

在農(nóng)殘檢測(cè)中常用的萃取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、甲醇等。因?yàn)橐译娴耐ㄓ眯詮?qiáng)，對(duì)農(nóng)藥的提取效率高，因此大多數(shù)農(nóng)殘檢測(cè)的前處理都采用乙腈作為提取液[10]。本研究考察了提取溶劑乙腈的體積及提取次數(shù)對(duì)提取效率的影響，即在GC/MS檢測(cè)后的空白無(wú)籽提汁基質(zhì)中添加各組分濃度為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，提取溶劑為乙腈，在其他操作條件相同條件下，分別比較提取溶劑10 mL提取2次、提取溶劑20 mL提取1次、提取溶劑20 mL提取2次的提取效果，最終以3次的平均值計(jì)算，以回收率作為驗(yàn)證指標(biāo)，結(jié)果顯示：即當(dāng)提取溶劑20 mL提取2次的提取效果要優(yōu)于提取溶劑20 mL提取1次及提取溶劑10 mL提取2次的提取效果，各組分的峰面積較大。所以實(shí)驗(yàn)中均已提取溶劑為乙腈，提取樣品2次，每次乙腈提取液體積為20 mL。

2.2 凈化條件-固相萃取柱的選擇及優(yōu)化

基質(zhì)的凈化步驟對(duì)最終的定量結(jié)果有著重要的影響。在分散固相萃取中常用的吸附劑有PSA、Cleannert NH2、C18和石墨化碳黑（GCB）等[11,12]。其中 PSA與Cleannert NH2對(duì)有機(jī)酸、色素、糖及脂肪等極性共提取物有較好的吸附能力；C18對(duì)除去非極性雜質(zhì)有很好的效果；而 GCB對(duì)色素、甾醇類和非極性干擾物有強(qiáng)烈的吸附作用，但同時(shí)也會(huì)吸附平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥[13]。而固相萃取柱中的凈化填料也大致相同，所以本研究選用了常見(jiàn)的水果及蔬菜農(nóng)殘中常用的凈化柱，比較凈化效果及對(duì)目標(biāo)物定量的影響，即分別選取Carb/NH2、PC/NH2、TPC三種固相萃取柱，在空白提子汁基質(zhì)中準(zhǔn)確添加各組分濃度為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，在相同的處理?xiàng)l件下利用不同固相萃取柱凈化后的結(jié)果及3種凈化效果較好的固相萃取柱的添加回收率結(jié)果如下表所示，最終結(jié)果以均值計(jì)算(n=5，單位為ng/mL)。

結(jié)果表明：針對(duì)36種農(nóng)藥在提子基質(zhì)中的添加回收實(shí)驗(yàn)利用PC/NH2固相萃取柱要優(yōu)于Carb/NH2固相萃取柱及TPC固相萃取柱，36種組分的回收率均在60%～120%，回收率在80%～120%占目標(biāo)物的58.3%。所以本實(shí)驗(yàn)中均以 PC/NH2固相萃取柱作為水果基質(zhì)的凈化柱。另外，甲苯是過(guò)柱后的良好淋洗劑，可提高部分農(nóng)殘目標(biāo)物的回收率，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，前處理中多數(shù)是利用乙腈-甲苯溶液（3+1）作為淋洗劑，但是淋洗液體積過(guò)多，里面的甲苯會(huì)引入更多雜質(zhì)到樣品中，濃縮上機(jī)后會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以本研究考察固相萃取柱凈化后，淋洗液體積對(duì)回收率的影響（即其他條件不變，淋洗液分別為6 mL、9 mL、12 mL、15 mL、18 mL、21 mL），結(jié)果表明當(dāng)淋洗液為12 mL時(shí)，回收率相對(duì)較高，且大多數(shù)目標(biāo)組分的均未超過(guò) 100%，所以實(shí)驗(yàn)中用 12 mL乙腈-甲苯溶液（3+1）分三次淋洗。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

由于在農(nóng)殘檢測(cè)時(shí)，如果利用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行直接定量，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，在常規(guī)色譜-質(zhì)譜法的方法確證過(guò)程中，一般采用同一來(lái)源的空白樣品配制系列標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控（QC）樣品，以抵消基質(zhì)效應(yīng)對(duì)方法的精密度和結(jié)果的準(zhǔn)確度產(chǎn)生的影響[14,15]。所以本研究也配制定量工作曲線溶液所使用的空白基質(zhì)與檢測(cè)樣品一一對(duì)應(yīng)，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正。無(wú)籽提汁基質(zhì)加標(biāo)(18.0 μg/kg)后的總離子流圖如圖1所示。

表2 經(jīng)不同固相萃取柱凈化后的添加回收率結(jié)果Table 2 The add recovery results of different solid phase extraction column after purification

圖1 無(wú)籽提基質(zhì)加標(biāo)(18.0 μg/kg)樣品在單離子檢測(cè)模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram in a single ion detection mode of a raisins matrix spiked (18.0 μg/kg) sample

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

在GC/MS確證的實(shí)驗(yàn)條件下，取無(wú)籽提樣品按樣品制備處理后，得到空白提取液，分別配制5個(gè)不同濃度70.0 ng/mL、140.0 ng/mL、280.0 ng/mL、350.0 ng/mL、560.0 ng/mL，的混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。采用標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和相對(duì)離子峰度比進(jìn)行定性，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果如表3所示，36種目標(biāo)物線性關(guān)系良好(R2＞0.99)。采用加標(biāo)回收的方法確定方法檢出限(LOD，S/N=3)和定量限(LOQ，S/N=10)分別為0.0001～0.0018 mg/kg和0.0002～0.0060 mg/kg，可滿足實(shí)際檢測(cè)的需要，符合GB2763-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量（MRLs）中規(guī)定的相關(guān)要求。

2.5 加標(biāo)回收率

稱取適量的空白無(wú)籽提汁樣品，分別添加3.5 μg/kg、7.0 μg/kg和18.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述優(yōu)化后的方法進(jìn)行處理，并進(jìn)行GC-MS分析，平行測(cè)定6次，回收率和精密度數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。由下表可見(jiàn)，36種化合物加標(biāo)回收率范圍在60.6%～116.5%之間，RSD(n=6)在0.8%～9.5%之間，表明本方法重復(fù)性良好。另外，本研究還選取蘋果、梨這兩種基質(zhì)分別添加濃度18.0 μg/kg，進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本方法的適用性，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為：蘋果基質(zhì)中添加的36種化合物加標(biāo)回收率范圍在65.4%～109.5%之間，RSD(n=6)在2.1%～7.7%之間；梨基質(zhì)中添加的36種化合物加標(biāo)回收率范圍在62.6%～119.7%之間，RSD(n=6)在1.2%～9.3%之間，該方法可以滿足準(zhǔn)確分析定量的要求，適用性較強(qiáng)，對(duì)仁果類，小型攀緣類及其他類水果也可參照?qǐng)?zhí)行。

表3 36種化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the 36 pesticides

注：Y：peak area of target compound；X：mass concentration of target compound；μg/L。

表4 36種化合物平均回收率與精密度Table 4 Average recoveries, relative standard deviation(RSD) of 36 kinds of compounds (n=6)

21 Endosulfan Sulfate (硫代硫酸酯) 104.9 1.9 92.8 4.7 105.3 3.2 22 p,p-DDT(p,p-滴滴涕) 95.6 1.8 82.9 3.9 60.6 3.4 23 Methoxychlor(甲氧滴滴涕) 69.2 1.3 89.4 3.4 86.2 1.9 24 Tetramethrin(胺菊酯) 62.6 1.5 78.5 3.8 87.1 2.7 25 Bifenthrin(聯(lián)苯菊酯) 74.4 2.1 91.5 3.4 93.2 2.7 26 Fenpropathrin(甲氰菊酯) 104.3 2.3 86.6 4.7 92.6 3.2 27 Cyhalothrin(氯氟氰菊酯) 92.9 1.4 85.2 4.5 84.1 2.2 28 Acrinathrin(氟丙菊酯) 80.6 2.3 63.4 3.8 81.9 2.2 29 Permethrin(氯菊酯) 64.7 3.1 73.4 5.7 71.1 4.4 30 Cyfluthrin(氟氯氰菊酯) 92.1 2.2 80.1 5.0 76.8 3.0 31 Cypermethrin(氯氰菊酯) 71.0 2.1 68.8 4.6 77.9 1.3 32 Flucythrinate(氟氰戊菊酯) 87.4 3.6 77.2 6.1 80.0 3.6 33 Silafluofen(氟硅菊酯) 105.1 4.9 85.7 6.8 88.4 6.0 34 Fenvalerate(氰戊菊酯) 91.5 6.9 86.7 7.1 86.3 8.8 35 Tau-fluvalinate(氟胺氰菊酯) 89.4 5.3 82.3 8.2 73.8 9.5 36 Deltamethrin(溴氰菊酯) 101.4 1.7 79.6 4.4 76.4 4.7

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本研究建立的方法對(duì) 2017年貴州省食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)委托送檢的50份水果樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在1份蘋果中檢出腐霉利農(nóng)藥，其含量為 4.05 μg/kg，未超過(guò)食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)評(píng)估中的限值要求。

另外為驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，此份蘋果樣品依據(jù)《GB 23200.8-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水果和蔬菜中 500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法》進(jìn)行測(cè)定，最終的腐霉利結(jié)果為 4.22 μg/kg（n=5，RSD(%)為 0.83），表明本方法的準(zhǔn)確度與國(guó)標(biāo)相一致。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)水果基質(zhì)通過(guò)不同種固相萃取柱凈化后的加標(biāo)回收考察實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)水果基質(zhì)凈化效果較好的固相萃取柱，通過(guò)優(yōu)化提取液體積、提取次數(shù)及凈化柱淋洗液體積等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立了固相萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水果中36種農(nóng)藥殘留量的方法，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 23200.8-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》基礎(chǔ)上，本方法將雙柱依次凈化優(yōu)化成單柱凈化，并減少了溶劑置換次數(shù)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率及靈敏度，使得該方法前處理步驟簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，回收率穩(wěn)定；適合仁果類，小型攀緣類等水果基質(zhì)中多組分農(nóng)藥殘留的篩查和確證，方法的定量限也能夠滿足國(guó)內(nèi)對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求。