陶紫，趙振剛

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

香茅草（Cymbopogoncitratus (DC.) Stapf）屬禾本科香茅屬（Cymbopogon），是著名草本香種，含天然檸檬香味，主要分布在東半球熱帶及亞熱帶國家。我國的香茅屬植物有8種，主要分布在南部地區(qū)[1]。因其具有和胃通氣、健胃消脂和降壓利尿等功效，香茅草在醫(yī)藥、日化、香精香料和飼料添加劑等行業(yè)應(yīng)用廣泛[2]。

香茅草精油 (Cymbopogoncitratus (DC.) Stapf essential oil，C-EO)具有廣泛的藥理活性：如，因具有一些香葉醛和橙花醛等醛類物質(zhì)，常作為抑菌材料[3]；有研究表明其主要成分中的檸檬醛物質(zhì)具有較理想的抗氧化能力，其清除O2·，OH·有顯著效果[4]。但因植物精油具有揮發(fā)性，對光線、氧氣、溫度敏感，且難溶于水，其在水環(huán)境中的運(yùn)用受限。因此，本研究擬通過選用合適的表面活性劑、助表面活性劑和水相，在一定比例條件下制備精油微乳體系，使其具有較精油本身更穩(wěn)定，更顯著的抗氧化活性。

微乳液（Microemulsion），由水、油、表面活性劑和助表面活性劑在適當(dāng)比例下自發(fā)形成，表現(xiàn)為透明或半透明、低粘度且各向同性[5]。因其穩(wěn)定性好、光散射弱、可設(shè)計(jì)成高粘性或者凝膠狀的流變性質(zhì)，并且可用來包埋親脂性活性成分的特點(diǎn)，微乳液在食品、制藥和化妝品行業(yè)均有廣泛的應(yīng)用價值[6,7]。而香茅草因其生長周期短，管理粗放，投資小見效快，且其精油在國際市場上價格較高，因此是一種極具商業(yè)價值的常青草本作物。本文結(jié)合C-EO和微乳技術(shù)，制備香茅草精油微乳體系（Cymbopogoncitratus (DC.)Stapf essential oil Microemulsion，M-EO）來克服精油本身因穩(wěn)定性差，難溶于水的弊端。通過繪制偽三元相圖考察各因素對微乳液形成的影響來優(yōu)化M-EO形成的工藝條件，尋找盡可能用更少的表面活性劑和助表面活性劑制備更穩(wěn)定的微乳液。最后采用 DPPH，ORAC和PSC法測定并比較C-EO及M-EO的抗氧化活性，以期找到一種提高C-EO穩(wěn)定性和增加其應(yīng)用范圍的方法，為拓展其商業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 材料與試劑

植物材料：香茅草購于廣州市一德路大型批發(fā)市場。

試劑：香茅草精油，自制；香茅草精油微乳液，自制；去離子水，自制；無水乙醇，廣東光華股份有限公司；丙二醇，天津大茂化學(xué)試劑公司；甘油，天津啟輪化學(xué)科技有限公司；Tween 80，Aladdin公司；Tween 60，Aladdin公司；Tween 20，Aladdin公司；2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（DPPH），西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易公司；Trolox，Sigma公司；沒食子酸，Sigma公司；2,7-二氯二氫熒光素二乙酯（DCFH-DA），Sigma公司；2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸（ABAP），Sigma公司；抗環(huán)血酸（Vc），Aladdin公司；熒光素鈉，Sigma公司；氫氧化鉀，國藥集團(tuán)；磷酸氫二鉀，上海生工生物工程有限公司；磷酸二氫鉀，上海生工生物工程有限公司；本實(shí)驗(yàn)中選用的其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

水蒸汽蒸餾裝置，常州普天儀器制造有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀（7890A-5975C DB-5ms），美國Agilent公司；氣相色譜毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）（Basis），美國 Agilent公司；Hei-VAP Value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國 Heidolph公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器公司；BSA2202S電子天平，德國 Sartorius公司；MS-H280-PRO磁力攪拌器，大龍磁力攪拌器有限公司；DDS-11A 5424R電導(dǎo)率儀，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；Nano-ZS納米粒度儀（ZETASIZER-HT），英國Malvern公司；DU730分光光度計(jì)，美國Beckman Coulter公司；Filter Max F5多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 C-EO的提取

參照魏娟[8]等提取姜黃精油的方法稍作修改，用水蒸氣蒸餾法對香茅草進(jìn)行蒸餾提取。采用水蒸汽蒸餾裝置，將自然風(fēng)干的香茅草剪切成5 cm左右長度，取10 kg原料于物料鍋中，以1：10的料液比加入100 kg水蒸餾。收集冷凝液得精油粗提物后，用石油醚萃取，加適量氯化鈉促進(jìn)水油分層，取上層液，重復(fù)萃取 2次。將所有上層液用無水硫酸鈉干燥，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去石油醚得澄清透亮的金黃色香茅草精油，最后密封于棕色玻璃瓶中避光保存。

1.3.2 C-EO成分氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析

采用安捷倫7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；色譜柱：Agilent DB-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣（99.999%）；柱流速：1 mL/min；進(jìn)樣量 0.2 μL；分流比 30：1；程序升溫：50 ℃，保持 3 min，3 ℃/min升到 120 ℃，4 ℃/min升到180 ℃，15 ℃/min升到292 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電離能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：33～450 u；檢索譜庫：Nist08，最后用峰面積計(jì)算各成分占的百分比含量。

1.3.3 香茅草精油微乳液（M-EO）制備及優(yōu)化

參照GUO Ruixue和MA Qiumin等[9,10]人制備微乳液的方法，并稍作修改。首先配置表面活性劑與助表面活性劑的混合液（混合活性劑，S+Cos），兩者的質(zhì)量比為Km，用磁力攪拌器攪拌均勻，靜置平衡。再往混合活性劑中加入精油攪拌均勻作為油相，混合活性劑與精油的質(zhì)量比表示為 Smix。隨后往油相中邊攪拌邊滴加水來獲得微乳液，通過繪制偽三元相圖表明各配方組分形成微乳液的能力。（本實(shí)驗(yàn)意得到 O/W型微乳液，因此在優(yōu)化微乳液制備工藝時只選擇水相占比在50%及以上的樣品作為實(shí)驗(yàn)對象。）

1.3.1.1 表面活性劑對M-EO形成的影響

分別用Tween 80，Tween 60，Tween 20作為表面活性劑，與無水乙醇配成 Km=4：1，3：1，2：1，1：1，1：0比例的混合活性劑，再配置 Smix=9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9 的油相。隨后往油相中邊攪拌邊滴加去離子水，配成水分含量分別為50%，60%，70%，80%，90%的配方組分。靜置平衡24 h，以4000 g的速度離心15 min，挑選出透明的樣品，繪制偽三元相圖。

1.3.3.2 助表面活性劑對M-EO形成的影響

以Tween 80為表面活性劑，分別以無水乙醇，1,2-丙二醇，甘油作為助表面活性劑，配成Km=3：1的混合活性劑。其他步驟同2.3.1。

1.3.3.3 Km值對M-EO形成的影響

以Tween 80為表面活性劑，以無水乙醇為助表面活性劑，配成 Km=4：1，3：1，2：1，1：1，1：0 的混合活性劑。其他步驟同2.3.1。

1.3.3.4 水相pH值對M-EO形成的影響

以Tween 80為表面活性劑，以無水乙醇為助表面活性劑，配成Km=3：1的混合活性劑。用0.1 M的鹽酸溶液以及0.1 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)去離子水的pH分別為1.5，4.0，9.0，以之作為水相滴加到混合好的油相中。其他步驟同2.3.1。

1.3.3.5 水相中離子強(qiáng)度對M-EO形成的影響

以Tween 80為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，配成Km=3：1的混合活性劑。用氯化鈉調(diào)節(jié)去離子水的離子強(qiáng)度，分別制成0.9%，2.0%的氯化鈉溶液。用該去離子水滴加到油相中。其他步驟同2.3.1。

1.3.3.6 M-EO的構(gòu)型分析和理化性質(zhì)

電導(dǎo)率變化規(guī)律和粘度變化測定是判定微乳液構(gòu)型的有效方法[11]，本文測定Smix=8：2，Km=3：1時，微乳體系電導(dǎo)率和粘度隨水分含量增加的變化規(guī)律。

將制備好的微乳液平衡24 h后，以4000 g的速度離心15 min。觀察其是否分層或渾濁。用Nano-ZS激光粒度儀測定微乳液的粒徑和分布（polydispersity index，PDI）。

1.3.4 C-EO及其微乳液抗氧化活性分析和比較

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考 Wang等[12]人方法并稍微修改，測定 C-EO及M-EO對DPPH自由基的清除能力。用無水乙醇溶解DPPH粉末并稀釋成2 mM的儲備液。取2 mL不同濃度的C-EO和M-EO溶液加入2 mL經(jīng)稀釋后的DPPH儲備液，渦旋均勻后，于室溫下避光反應(yīng) 30 min，在517 nm處測定吸光值A(chǔ)i。以無水乙醇作為空白調(diào)零，以2 mL對應(yīng)濃度的測試樣的溶液加上2 mL無水乙醇作為對照（Aj）。2 mL無水乙醇加2 mL DPPH工作液的吸光值為Ac。則測試樣對DPPH自由基的清除能力為：

DPPH自由基清除率（%）=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%1.3.4.2 氧自由基吸收能力（Oxygen Radical Absorption Capacity，ORAC）的測定

參照 Davalos[13]的方法，本實(shí)驗(yàn)用磷酸鹽作為緩沖液（PBS，pH 7.4）；以 Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品。用 PBS配置系列濃度的 Trolox標(biāo)準(zhǔn)液（6.25，12.5，25，50 μM）；樣品C-EO和M-EO直接用PBS稀釋。具體操作流程：在96孔黑色底部透明微孔板中依次加入20 μL抗氧化物質(zhì)（Trolox或待測樣品），于37 ℃環(huán)境下孵育10 min；隨后往每個孔中加入200 μL熒光素鈉溶液，孵育 20 min；隨后每個孔中迅速加入 20 μL的ABAP溶液（空白對照孔加20 μL PBS）；最后用多功能酶標(biāo)儀測定各孔熒光度變化（激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長538 nm，每5 min測定一次，測定時長150 min）。所有測試樣均做三次平行。

標(biāo)品或者樣品的熒光保護(hù)面積（Net AUC）等于標(biāo)品或樣品作用下的衰退曲線面積（AUC）減去空白對照作用的熒光衰退 AUC而得的熒光熄滅曲線的延遲部分面積（Net AUC=AUCsample-AUCblank）。樣品的氧自由基清除能力ORAC值，由其熒光衰退曲線的保護(hù)面積與標(biāo)品 Trolox的保護(hù)面積相比而得[ORAC=(Net AUCsample/Net AUCtrolox)×(Mtrolox/Msample)]。即，最后樣品的ORAC值表示為每毫克樣品的Trolox當(dāng)量（μM Trolox equiv/mg，DW）。

1.3.4.3 過氧自由基清除能力（Rapid peroxy radical scavenging capacity，PSC）的測定

參照Adom等[14]對天然提取物過氧自由基清除能力的分析方法。以沒食子酸和抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋為5個系列濃度梯度；測試樣為C-EO或M-EO，用PBS稀釋成5個系列梯度；DCFH-DA在使用前用1 mM的氫氧化鉀水解，并用PBS稀釋。具體操作步驟為：在96孔黑色底部透明微孔板的微孔中依次加入 100 μL抗氧化物質(zhì)（PBS（空白組），標(biāo)準(zhǔn)品或者測試樣），100 μL水解后的DCFH-DA，50 μL ABAP溶液。最后用多功能酶標(biāo)儀測定各孔熒光度變化（激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長538 nm，每5 min測定一次，時常40 min）。

樣品的 PSC值為每組稀釋液的熒光強(qiáng)度變化的時間動力曲線面積。以SA為標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品的熒光積累量，CA為空白對照的熒光積累量，PSC值=1-（SA/CA）。以EC50值（即阻止50%熒光（PSC=0.5）產(chǎn)生所需要的測試樣的濃度）作為最終比較抗氧化活性的指數(shù)。樣品的抗氧化能力表示為μmol Vc equiv/g,DW。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

文中用origin 8.5軟件繪制圖表，Sigmaplot 12.5處理曲線面積積分，Calcusyn 2.0計(jì)算濃度效應(yīng)，IBM SPSS21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行 AANVOA顯著性比較分析（p＜0.05時，表明具有顯著性差異）。所有實(shí)驗(yàn)均做3個平行，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 C-EO的化學(xué)成分

采用水蒸氣蒸餾法提取得到C-EO，利用GC-MS技術(shù)對精油進(jìn)行成分分析，共檢測出 M-EO具有 64種揮發(fā)性組分，占色譜餾分出峰總面積的96.60%。其主要成分如表1所示。其中相對濃度在1%以上的有16種，占總量的91.78%，其中超過60%成分為醇、醛或者烯類小分子物質(zhì)。含量最高的4種成分別是（+）-香茅醛（35.69%），香葉醇（16.56%），D-芳香醇（12.47%），D-檸檬烯（3.77%），分別占其總量68.49%。

表1 C-EO揮發(fā)性成分中相對濃度在1%以上的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of C-EO in the relative concentration of more than 1%

由表1可知，本次研究對象的主要成分是一些醛、醇、烯和酯類物質(zhì)。有報(bào)道表示，香茅草中含量較高醛醇物質(zhì)，具有顯著的抗菌活性，提高免疫細(xì)胞活性以及抗炎癥作用[15,16]。更有一些動物實(shí)驗(yàn)研究表明，香茅草提取物可減少體內(nèi)活性氧含量，提高血清總抗氧化能力，同時也可與其他成分作用產(chǎn)生協(xié)同效果提高總體抗氧化活性[17,18]。因此，香茅草精油成分分析為其之后的活性研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 M-EO的制備和條件優(yōu)化

圖1 各組成組分對M-EO形成的影響Fig.1 Effects of various components on pseudo-ternary phase diagrams

2.2.2.1 表面活性劑對M-EO形成的影響

表面活性劑是構(gòu)成微乳液的基本物質(zhì)，可降低界面張力促進(jìn)微乳形成。因無毒、價格低廉和乳化效果顯著等優(yōu)勢，Tween系列表面活性劑被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品以及醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域[19]。本實(shí)驗(yàn)選用Tween 80，Tween 60，Tween 20作為研究對象，選出較優(yōu)的表面活性劑。如圖 1A 中顯示，當(dāng) Km=3：1，Smix=8：2時，Tween 80的微乳區(qū)域面積大于Tween 60，而Tween 20在該體系中不能構(gòu)成微乳液。該結(jié)果由各表面活性劑的理化性質(zhì)決定：首先是 HLB值（Hydrophile Lipophilic Balance），HLB值反應(yīng)表面活性劑中的親水基團(tuán)與親油基團(tuán)的平衡關(guān)系，值越高，親水性越強(qiáng)。在已知選用的表面活性劑中，Tween 80的HLB值最大，Tween 60次之，Tween 20最小。因此，欲要獲得O/W型微乳液，應(yīng)選用Tween 80作為表面活性劑。

2.2.2.2 助表面活性劑對M-EO形成的影響

圖2 以1,2-丙二醇和甘油為助表面活性劑的臨界配方組分Fig.2 Sample figures in critical conditions with cosurfactants of 1, 2-propylene glycol and glycerinum

本研究選用無水乙醇，1,2-丙二醇，甘油作為助表面活性劑。由圖1b的偽三元相圖可知，無水乙醇對應(yīng)的微乳區(qū)域面積最大，其余兩者無顯著區(qū)別。根據(jù)實(shí)際效果觀察分析，甘油的助乳化效果稍強(qiáng)于 1,2-丙二醇（圖2）。圖2表示1,2-丙二醇和甘油制備成微乳液的一些臨界條件的配方組成。其中 A2與 A5，B3與B6，C2與C5均是1,2-丙二醇和甘油在相同Km值，Smix值以及水分含量條件下的不同表現(xiàn)。從清晰透明度方面的對比可看出甘油的A5，B6，C5分別優(yōu)于1,2-丙二醇同一條件下對應(yīng)的A2，B3和C2。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無水乙醇優(yōu)于甘油，1,2-丙二醇的效果最差。助表面活性劑的作用大小跟醇鏈本身的大小以及所帶基團(tuán)有關(guān)。Gradzielski[20]的報(bào)道表明，在非離子型O/W型微乳中加入短鏈醇可降低界面膜的彎曲系數(shù)，在水油界面上與表面活性劑形成混合吸附膜，降低表面張力，增加界面膜的柔性和流動性，減少微乳液形成所需的彎曲能；同時還可調(diào)節(jié)體系中的 HLB值以利于乳液形成。根據(jù) Garti等[21]的解釋，由于乙醇分子量和摩爾體積都較小，易于穿透微乳液第的柵欄層引起界面膜向油相凸起而利于微乳液的形成。而相同鏈長的短鏈醇，帶有的羥基越多，其親水性和極性越強(qiáng)，在一定條件下有利于親水型微乳液的形成。

2.2.2.3 Km值對M-EO形成的影響

以Tween 80為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，按 Km=4：1，3：1，2：1，1：1，1：0 的比例混合，繪制偽三元相圖，如圖1C所示。由圖可知，隨著表面活性劑的占比升高，微乳區(qū)域面積增加。其中Km=4：1（圖 1C1），1：0（圖 1C5）的微乳區(qū)域面積最大，Km=1：1（圖1C4）的微乳區(qū)域面積最小。這是由于Km值減小時，助表面活性劑含量進(jìn)一步增加，油-水界面的張力降低，表面活性劑頭基之間的吸引力減小，體系形成微乳液的能力減弱，從而微乳區(qū)域面積減小[22]。當(dāng) Km=4：1，3：1，1：0 時，三者的微乳區(qū)域面積相差不大，考慮產(chǎn)品最后應(yīng)用的安全性和可適用性，優(yōu)先選用表面活性劑更少的比例組分，因此本實(shí)驗(yàn)篩選出Km=3：1的比例。

2.2.2.4 水相pH值對M-EO形成的影響

以Tween 80為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，其中Km=3：1，Smix=8：2。用 0.1 M 的鹽酸和 0.1 M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)去離子水的pH作為水相。由圖1D可知，直接用去離子水制備的微乳區(qū)域面積最大（圖1D3），隨著pH值越低，其區(qū)域面積越小。當(dāng)pH值增加，體系呈現(xiàn)堿性，其微乳區(qū)域面積也受到影響而減?。▓D1D4）。該結(jié)果表明，中性的水相環(huán)境更利于微乳液的形成，王浩[23]在制備丁香油微乳體系時得到相似結(jié)果。

2.2.2.5 水相中離子強(qiáng)度對M-EO形成的影響

以Tween 80為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，其中Km=3：1，Smix=8：2。配置0.9%和2%的氯化鈉溶液作為水相。其偽三元相圖如圖 1E所示，微乳區(qū)域面積隨離子強(qiáng)度的變化相差不大，但是從臨界配方組分的樣品中觀察可知（圖3），實(shí)際上2%的氯化鈉溶液樣品的清晰透明度優(yōu)于0.9%的樣品，而去離子水的清晰度最弱。

圖3 離子強(qiáng)度對M-EO形成的影響Fig.3 Effects of ionic strength on pseudoternary phase diagrams

圖3中，在Km=3：1和Smix=8：2，水分含量為90%的條件下，A2與A3的透明度高于A1；同時，當(dāng)Km=3：1和Smix=7：3，水分含量為90%時，B2和B3的清晰透明度明顯優(yōu)于B1。因此，在低離子強(qiáng)度下，隨著離子強(qiáng)度的升高，體系的微乳化效果更好，這是由于低濃度的氯化鈉溶液會迫使表面活性劑與水相分離，而與更多的油相形成反膠束，增加油相的載入，乳化效果更好。但是，當(dāng)鹽度過高，離子強(qiáng)度過大時，其對非離子型微乳液體系影響會較大。這是因?yàn)楦邼舛鹊柠}溶液會產(chǎn)生鹽析作用，降低表面活性劑的親水能力，使其微乳形成能力減弱[24]。

2.3 M-EO構(gòu)型的確定及其理化性質(zhì)

2.3.1 M-EO構(gòu)型的確定

圖4表示當(dāng)Km=3：1，Smix=8：2時，體系中電導(dǎo)率和粘度隨水含量增加的變化趨勢。

電導(dǎo)率的測定可以揭示微乳液體系的相變轉(zhuǎn)化。由圖4可知，體系的電導(dǎo)率在水含量小于30%時緩慢增加；當(dāng)水含量在30%至60%時，電導(dǎo)率變化曲線斜率最大，隨后增加速度減緩；當(dāng)水含量大于70%，電導(dǎo)率有回落趨勢。該變化規(guī)律表明，當(dāng)水含量超過70%時，體系為O/W型微乳液。這是由于在低含水量的非離子型微乳液中，水相為內(nèi)相，油相為連續(xù)相（W/O型）。電場作用下，小液滴在油相中泳動，碰撞時內(nèi)核中的電解質(zhì)離子穿過界面膜發(fā)生躍遷，隨著電解質(zhì)離子增加，離子躍遷次數(shù)增加，導(dǎo)致電導(dǎo)率逐漸上升。當(dāng)水含量繼續(xù)增加，液滴進(jìn)一步膨脹，界面膜曲率增加，強(qiáng)度降低，電解質(zhì)離子容易穿透，顆粒間相互距離接近，使得液滴間相互連接，形成導(dǎo)電鏈，電導(dǎo)急劇上升，使得電導(dǎo)率快速升高（B.C型）。接著導(dǎo)電鏈發(fā)展完善，隨水含量繼續(xù)增加，電導(dǎo)率的緩慢上升僅是由于增加電解質(zhì)溶液的結(jié)果。當(dāng)再增加水含量后，體系中導(dǎo)電離子是O/W型微顆粒，水分的增加導(dǎo)致體系不斷被稀釋，微乳液滴濃度降低，導(dǎo)致電導(dǎo)率下降[25]。

同樣，圖4中的粘度變化規(guī)律與電導(dǎo)率變化規(guī)律相似。當(dāng)水分含量低于30%時，體系粘度緩慢增加；當(dāng)含水量超過30%，粘度上升速度顯著提升，在50%處達(dá)到最大值，隨后急劇降低；當(dāng)水分含量達(dá)到70%后，粘度變化變緩。一開始粘度的緩慢增加是由于W/O型液滴體積增加，液滴間相互作用力增大；隨后的急劇增加則是因?yàn)殡S著水含量繼續(xù)增加，分散顆粒增大，小球團(tuán)形成，相互作用力增強(qiáng)（B.C型）；突然的降低則是因?yàn)锽.C型乳液向O/W型轉(zhuǎn)變，此時以水相為連續(xù)相；水含量超過70%時，體系中的粘度變化則是由于更小的液滴的形成以及 O/W 型液滴的進(jìn)一步稀釋。通過電導(dǎo)率和粘度的測定可知，O/W型微乳液的水分含量在70%左右。

圖4 M-EO體系電導(dǎo)率和粘度的變化曲線Fig.4 The electrical conductivity and viscosity curves of M-EO with different water content

2.3.2 M-EO的穩(wěn)定性和理化性質(zhì)

穩(wěn)定性是微乳體系的重要參數(shù)，可作為該微乳體系質(zhì)量的評價指標(biāo)。制備好的微乳液在室溫下平衡24 h，篩選出無可見渾濁或沉淀的樣品。隨后通過小型高速冷凍離心機(jī)在4000 g的條件下離心10 min，沒有分層現(xiàn)象。

2.3.3 M-EO的理化性質(zhì)

為了獲得 O/W 型微乳液體系來改善精油水溶性差的問題以及進(jìn)一步評估所制M-EO的性質(zhì)，測定了Km=3：1，Smix=8：2，含水量為 70%配方組分樣品的粘度，電導(dǎo)率，粒徑，以及用去離子水稀釋100倍和200倍后其粒徑和PDI值的變化，其結(jié)果如表2所示。微乳液的原始粒徑為16.50±0.53 nm，經(jīng)過100倍、200倍稀釋后，粒徑均有小幅度減小。樣品的PDI值變化規(guī)律顯示原始樣和稀釋樣的PDI值約為0.3，說明該微乳體系具有較理想的均勻性。由此判斷，所選的Km=3：1，Smix=8：2，水分含量為70%的香茅草精油配方組分是較穩(wěn)定、均勻、理想的微乳體系。

表2 香茅草精油微乳液的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical parameters of M-EO

2.4 C-EO及其微乳液的體外抗氧化活性研究分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

本實(shí)驗(yàn)選擇 Km=3：1，Smix=8：2，水分含量分別為15%，50%，70%的微乳體系作為研究C-EO及其微乳液DPPH自由基清除能力的對象。

C-EO及其微乳液對DPPH自由基的清除能力如圖5所示。圖中表示C-EO及其不同水分含量M-EO的DPPH自由基清除率的EC50值，其中C-EO的EC50值約為0.26 mg/mL，顯著低于其微乳液。表明C-EO的DPPH自由基抑制率優(yōu)于其微乳液。在其三個配方組分的微乳液中，70%組分和 50%組分均顯著優(yōu)于15%的組分。同時，本實(shí)驗(yàn)也采用抗壞血酸作為陽性對照（圖5B），以Vc當(dāng)量表示DPPH自由基清除效果。其中C-EO的Vc當(dāng)量約為162.88 μmol Vc equiv/g，70%和50%水分含量微乳的Vc當(dāng)量相當(dāng)，分別約為23.97 μmol Vc equiv/g，22.94 μmol Vc equiv/g，而 15%的組分活性最低。這可能是因?yàn)镈PPH自由基清除實(shí)驗(yàn)以無水乙醇溶解樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，脂溶性的精油可直接發(fā)生反應(yīng)，因此優(yōu)于已組成顆粒的微乳液。而不同水分含量的微乳液的活性差異源于水分含量較高的組分，其顆粒較均勻，穩(wěn)定性好；而70%配方組分與50%配方組分活性相當(dāng)，主要是因?yàn)橄鄬τ贠/W型的70%配方組分，脂溶性環(huán)境更利于50%配方組分（B.C型微乳液）；15%水分含量的組分由于油相成分過高，其流動性和均勻度都低于水分含量較高的組分，因此DPPH自由基清除效果次于70%和50%的配方組分。

圖5 C-EO及其微乳液的DPPH自由基清除能力Fig.5 The DPPH radical scavenging activity of C-EO and its microemulsions. (a) The EC50 value of DPPH radical scavenging rate. (b) The ascorbic acidequivalent of DPPH radical scavenging ability.

3.4.2 氧自由基和過氧自由基清除能力的測定（ORAC和PSC法）

由于本研究是為改善脂溶性精油在水溶性環(huán)境中運(yùn)用，因此選擇水溶性O(shè)RAC和PSC方法比較C-EO和M-EO的抗氧化活性，其結(jié)果如圖6所示。

圖6a表示C-EO及其微乳液的ORAC值，前者的ORAC值約為0.35 μmol Trolox equiv/mg，顯著低于其微乳液的 ORAC值（70%配方組分：1.94 μmol Trolox equiv/mg；50%配方組分：1.11 Trolox equiv/mg）。類似的結(jié)果也在圖6B中樣品的PSC值中體現(xiàn)：C-EO的PSC值為1.53 Vc equiv/g，其微乳液中70%配方組分的PSC值達(dá)32.15 Vc equiv/g，50%配方組分達(dá)28.16 Vc equiv/g，即M-EO的活性均顯著優(yōu)于香茅草自身的抗氧化活性。香茅草精油微乳液對氧自由基和過氧自由基的清除能力高于其精油本身，主要是ORAC和PSC法是在水溶性體系中進(jìn)行，而微乳液的形成克服了精油水溶性差的特點(diǎn)，提高了精油在水環(huán)境中清除自由基的能力。

圖6 C-EO及其微乳液對氧自由基和過氧自由的基清除能力Fig.6 The Oxygen radical and peroxyl radical scavenging capacity of C-EO and its microemulsions. (a) The ORAC value.(b) The PSC value

水分含量高的配方組分顯示出更高的抗氧化活性是因?yàn)?0%配方組分的M-EO是O/W型微乳液，相對于50%配方組分（B.C型）微乳液具有更高均一度的顆粒和均勻的體系，有利于樣品發(fā)揮其活性作用。本文是首次采用ORAC值和PSC值方法評價香茅草及其微乳液的抗氧化能力的報(bào)道，因?yàn)镺RAC和PSC方法均采用ABAP作為自由基，其產(chǎn)生的自由基性質(zhì)更接機(jī)于生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，其可更好的分析抗氧化物質(zhì)對由氧或過氧自由基引起的機(jī)體損傷的抑制，為今后開發(fā)香茅草精油為功能性食品或者藥品提供理論基礎(chǔ)[26]。

3 結(jié)論

本文采用水蒸餾法提取C-EO，并用GC-MS技術(shù)分析精油主要揮發(fā)性行成分。結(jié)果表明其主要物質(zhì)有（+）-香茅醛（35.69%），香葉醇（16.56%），D-芳香醇（12.47%），D-檸檬烯（3.77%）。隨后制備并優(yōu)化精油的M-EO體系，最終挑選出由C-EO，Tween 80，無水乙醇，去離子水組成，且 Km=3：1，Smix=8：2，水分含量為70%的O/W型的穩(wěn)定均一的理想微乳液。本研究最后通過 DPPH，ORAC及 PSC法分析比較C-EO及M-EO的體外抗氧化作用。結(jié)果顯示，M-EO在水相環(huán)境中的抗氧化活性顯著優(yōu)于 C-EO，具有開發(fā)為天然抗氧化劑的潛力。本文構(gòu)建的微乳液體系，解決了C-EO在應(yīng)用過程中水溶性差等問題，拓展了其在食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。關(guān)于精油其他生物活性是否增強(qiáng)，則需再進(jìn)一步的研究。