曲文娟，張?zhí)?，馬海樂(lè)，何榮海

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

通過(guò)改變基因組來(lái)進(jìn)行微生物的培育對(duì)于生物技術(shù)研究和生物產(chǎn)業(yè)是非常重要的。在自然界中，突變和自然選擇結(jié)合是生命進(jìn)化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力[1]。但是自然進(jìn)化自發(fā)突變率低，造成進(jìn)化效率不高并且需要很長(zhǎng)時(shí)間[2]，所以為了提高突變率和篩選出有益的變種，很多人造的誘變技術(shù)已經(jīng)被廣泛研究和應(yīng)用起來(lái)。迄今為止，化學(xué)和物理誘變劑已經(jīng)在工業(yè)菌株改造中發(fā)揮著重要作用[3]，雖然化學(xué)誘變劑是有效的、經(jīng)典的誘變手段，但是化學(xué)誘變劑多為劇毒的致癌物質(zhì)，所以研究者目前也更傾向于利用物理法來(lái)進(jìn)行誘變處理。

常壓室溫等離子體（ARTP）是一種新型的微生物誘變工具，在常壓常溫下（25～40 ℃）能瞬間破壞DNA鏈，避免對(duì)熱敏微生物的潛在熱損傷[4]。與傳統(tǒng)的誘變育種相比，ARTP誘變育種有更強(qiáng)的DNA損傷，較高的突變率，并且突變菌株由良好的遺傳穩(wěn)定性[5,6]。大量的研究也證實(shí)了ARTP對(duì)微生物的誘變有顯著的正效應(yīng)。MA[7]利用ARTP成功誘變出了一株高產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌WB600 mut-12#，與未誘變的菌株相比，淀粉酶的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別增加了35.0%和8.8%，胞外蛋白濃度增加了37.9%，表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。

ZHU等[8]以產(chǎn)脂肽的枯草芽孢桿菌 723作為親本，利用ARTP誘變技術(shù)以及高通量篩選方法，篩選出了27,000個(gè)突變體，發(fā)現(xiàn)了37個(gè)高產(chǎn)菌株，其中一株的產(chǎn)脂肽含量是親本的5.4倍。FAN等[9]用ARTP改善工程化枯草芽孢桿菌TD12np尿苷的生產(chǎn)量，通過(guò)建立的高通量篩選方法篩選出了一株突變體F126，F(xiàn)126菌用于搖瓶發(fā)酵30 h和分批補(bǔ)料發(fā)酵48 h后，產(chǎn)生的尿苷含量比親本分別提高了4.4倍和8.7倍。但是目前沒(méi)有關(guān)于ARTP處理產(chǎn)中性蛋白酶的解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens 10160的任何報(bào)道，所以本研究采用 ARTP技術(shù)對(duì)產(chǎn)中性蛋白酶的Bacillus amyloliquefaciens 10160進(jìn)行誘變改造，以提高其產(chǎn)中性蛋白酶的能力，從而提高豆粕液態(tài)發(fā)酵制備降血壓肽的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Bacillus amyloliquefaciens 10160，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；豆粕（蛋白含量 48.48%），購(gòu)自中儲(chǔ)糧鎮(zhèn)江有限公司；三氯乙酸（TCA）、甲叉丙烯酰胺、丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、冰醋酸、乙腈和考馬斯亮藍(lán) R-250，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)；溶菌酶、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸和四甲基乙二胺（TEMED），購(gòu)自上海生工；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）和馬尿酰-組氨酸-亮氨酸（HHL），購(gòu)自sigma。

1.2 設(shè)備與儀器

IS-RDD3搖床，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司；YM30Z滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ARTP誘變育種儀，無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸取物5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

酪素培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、酪素8 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。

種子培養(yǎng)基[10]：酵母膏1%（m/V）、玉米黃粉1%（m/V）、KH2PO41%（m/V），121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕 20% （m/V）、玉米黃粉 1%（m/V）、KH2PO40.5%（m/V），121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 菌體懸浮液制備

將Bacillus amyloliquefaciens 10160接種到LB培養(yǎng)基中36 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屖咕w濃度保持在106CFU/mL，然后取10 mL稀釋后的菌體4000 r/min、4 ℃條件下離心處理10 min，取離心后的沉淀物用10 mL無(wú)菌生理鹽水懸浮，然后進(jìn)行等離子體誘變處理。

1.3.3 等離子誘變處理

將上述菌體懸浮液與10% (V/V)甘油按1：1的比例混合，混合后取 20 μL均勻涂在無(wú)菌載玻片上，在ARTP上進(jìn)行誘變，處理結(jié)束后，用1 mL的無(wú)菌生理鹽水將載片上的菌體清洗后待測(cè)。

ARTP功率設(shè)定為 100 W，通氣量設(shè)定為 10 L/min，利用冷卻水循環(huán)機(jī)，控制溫度為20 ℃，通過(guò)改變誘變時(shí)間（2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 s）來(lái)計(jì)算誘變致死率，以未誘變處理的菌體作為對(duì)照，根據(jù)致死率（%）確定最終的誘變條件。

1.3.4 初篩方法

將誘變完的菌體稀釋合適的濃度，涂于酪素培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h（36 ℃）后，記錄培養(yǎng)基上菌落和水解圈直徑，根據(jù)公式計(jì)算K值[11]。初篩的標(biāo)準(zhǔn)為菌落直徑在1.0～2.0之間且K值較大。對(duì)初篩得到的菌落進(jìn)行斜面保存。

1.3.5 復(fù)篩方法

將初篩得到的菌株接種到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)（36 ℃）24 h，然后離心取上清液，按照國(guó)標(biāo)GB/T 23527-2009[12]測(cè)定其中性蛋白酶的酶活。

1.3.6 誘變菌株產(chǎn)蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選出的蛋白酶活顯著提高的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，對(duì)突變菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，選取第1、3、5、7和9代的菌株搖瓶培養(yǎng)(36 ℃)24 h后，測(cè)定中性蛋白酶酶活，來(lái)確定篩選出的突變菌株的穩(wěn)定性。

1.3.7 誘變機(jī)理試驗(yàn)

1.3.7.1 菌體蛋白樣品的制備

參考石坡[13]的方法制備菌體蛋白樣品。

1.3.7.2 菌體蛋白濃度的測(cè)定

采用Bradford（1976）法[14]測(cè)定樣品中蛋白濃度。

1.3.7.3 SDS-PAGE電泳

（1）濃縮膠配方見(jiàn)表1。

（2）分離膠配方見(jiàn)表2。

表1 濃縮膠配方Table 1 The formula of concentration gel

表2 分離膠配方Table 2 The formula of separation gel

（3）電極緩沖液：稱(chēng)取15.1 g Tris、94 g甘氨酸，加入5.0 g SDS，用去離子水溶解并定容到1 L，調(diào)至pH 8.3。

（4）脫色液配方：量取100 mL醋酸和50 mL乙醇，加入去離子水定容到1 L。

（5）SDS-PAGE操作步驟：將20 μL電泳菌體蛋白樣品與5 μL上樣緩沖液混合，在沸水浴中煮5 min，根據(jù)樣品的蛋白濃度計(jì)算出上樣的體積，使上樣蛋白量達(dá)到 15 μg，然后緩慢的在梳孔中加樣，濃縮膠穩(wěn)壓80 V，分離膠穩(wěn)壓120 V，電泳時(shí)間2 h。取下凝膠后，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h。染色結(jié)束后，加入脫色液脫色過(guò)夜。

1.3.8 豆粕液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)

將篩選出的蛋白酶活性高且穩(wěn)定性好的兩株突變菌進(jìn)行豆粕液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，5000 r/min離心15 min取上清液用于測(cè)定各類(lèi)指標(biāo)，其結(jié)果與初始菌株Bacillus amyloliquefaciens 10160發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行比較。

豆粕液態(tài)發(fā)酵的工藝條件為：豆粕添加量 20%（m/V）、KH2PO4濃度0.5%（m/V）、玉米黃粉（提供碳源和氮源）添加量1%（m/V）、溫度32 ℃、自然pH（5.8）、接種量10%（V/V）、發(fā)酵時(shí)間24 h。

1.3.8.1 多肽含量的測(cè)定

參照陳鈞輝等[15]雙縮脲法測(cè)定多肽濃度。多肽含量（%）計(jì)算公式如下：

式中：C，發(fā)酵液的多肽濃度，mg/mL；V，發(fā)酵液的總體積，mL；m，發(fā)酵液放入105 ℃烘箱中烘干至恒重后的質(zhì)量，mg。

1.3.8.2 多肽得率的測(cè)定

樣品的多肽得率（%）計(jì)算公式如下：

式中：M，豆粕和玉米粉總質(zhì)量，mg。

1.3.8.3 ACE抑制率的測(cè)定

取發(fā)酵上清液與15%（m/V）TCA按1：1的比例混合均勻，30 ℃反應(yīng)30 min后10000 r/min離心10 min，然后取上清液調(diào)節(jié)pH為中性，用去離子水將上清液統(tǒng)一稀釋到10 mg/mL后，參考JIA[16]的ACE抑制率方法測(cè)定ACE抑制率（%）。

1.3.8.4 發(fā)酵液分子量分布的測(cè)定

參考 JIN[17]的方法測(cè)定。采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定多肽的分子量分布。色譜柱：TSK-gelG2000（300 mm×7.8 mm）。

將發(fā)酵上清液配置成濃度10 mg/mL的樣品溶液，依據(jù)上述方法進(jìn)行分析計(jì)算出多肽的相對(duì)分子量及其分布范圍所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）。

1.3.8.5 發(fā)酵液上清液酶活的測(cè)定

中性和堿性蛋白酶酶活參考國(guó)標(biāo) GB/T 23527-2009[12]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有測(cè)量數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析，以p＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 致死率曲線繪制結(jié)果

采用平板計(jì)數(shù)法繪制 Bacillus amyloliquefaciens 10160的ARTP誘變致死率曲線，建立ARTP誘變時(shí)間與致死率的關(guān)系曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 ARTP處理時(shí)間與致死率的關(guān)系曲線Fig.1 Relation curve between ARTP treatment time and lethality

由圖1可知，在處理時(shí)間在2～12 s之間時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，致死率迅速的增加。研究報(bào)道顯示[18]，菌體突變率會(huì)隨著誘變劑量的增加而增加，但是當(dāng)達(dá)到一定的誘變劑量，負(fù)突變率會(huì)增高，正突變率有所下降，誘變劑量使致死率在80%時(shí)[19]，正突變率高，誘變效果較好。推測(cè)可能是因?yàn)锳RTP產(chǎn)生的活性粒子能夠穿透細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，破壞DNA、蛋白鍵等，當(dāng)能量適中時(shí)，細(xì)胞中DNA不完全修復(fù)引起控制產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物的遺傳片段的改變，最終導(dǎo)致性狀發(fā)生改變；當(dāng)能量過(guò)大時(shí)，對(duì)DNA鍵的破壞較大，菌體自身很難修復(fù)，控制目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的基因沒(méi)有得到修復(fù)反而產(chǎn)生了負(fù)效應(yīng)[20,21]。本研究結(jié)果顯示在誘變時(shí)間為10 s時(shí)，致死率達(dá)到80.0%，因此ARTP誘變處理時(shí)間10 s最適宜，并將其用于后續(xù)試驗(yàn)中。

2.2 初篩結(jié)果

將ARTP處理后的菌株在酪素篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，從誘變后的菌落中得到K值較大的12株菌體，結(jié)果見(jiàn)表3。K值在一定程度上反映了菌體分泌的蛋白酶的酶活力大小，K值越大表示菌體分泌的蛋白酶分解酪素的能力越高，酶活力越高。從表中可以看出，與初始菌株相比，誘變后12株菌C1～C12的K值分別提高了33.37%、32.00%、6.76%、18.48%、21.33%、40.23%、10.24%、22.49%、12.04%、18.48%、33.37%和46.57%。在這12株誘變菌中，K值增加較顯著的菌株為C1、C2、C5、C6、C8、C11和C12，增加率均大于20%。根據(jù)邢新會(huì)等[22]對(duì)ARTP誘變出來(lái)的高產(chǎn)色氨酸大腸桿菌，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行基因組重測(cè)序并進(jìn)行COG分類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)16組基因與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)，推測(cè)ARTP處理造成K值的增加可能是因?yàn)锳RTP通過(guò)發(fā)射等離子體射流，穿過(guò)細(xì)胞膜使控制蛋白酶產(chǎn)生的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，引起代謝通路的改變，從而導(dǎo)致分泌的胞外蛋白酶活性提高。舒冬梅等[9]利用酪素培養(yǎng)基對(duì)ARTP誘變后的米曲酶進(jìn)行初篩時(shí)，也篩選出了與初始菌株K值（1.13）相比較大的三株菌（2.00、1.88和2.14）。

表3 初篩菌株的水解圈直徑、菌直徑和K值Table 3 Hydrolysis circle diameter, bacteria diameter, and K values of strains by initial screening

2.3 復(fù)篩結(jié)果

表4 復(fù)篩菌株中性蛋白酶酶活Table 4 Neutral protease enzyme activities of strains by secondary screening

雖然可以從酪素篩選平板上篩選出正突變的菌株，但是其篩選的結(jié)果存在一定的誤差，所以需要進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證[23]，對(duì)表3中的12株菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩測(cè)定其中性蛋白酶酶活，中性蛋白酶酶活力結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出，與初始菌株相比，12株菌的中性蛋白酶酶活力都有不同程度的增加，其中C1、C2、C5和C12四株菌的產(chǎn)酶活力增加較大，中性蛋白酶酶活分別為66.23、62.65、66.14和76.04 U/mL，與初始菌株相比，酶活增加率都大于50%，比舒冬梅等[11]用ARTP誘變產(chǎn)蛋白酶的米曲酶篩選出的誘變菌株的中性蛋白酶酶活提升（19.1%）效果好。ARTP能夠使誘變菌株分泌的蛋白酶活力不同程度的提升，這可能是因?yàn)锳RTP產(chǎn)生的等離子射流中包含多種具有化學(xué)活性的粒子，對(duì)胞內(nèi)DNA損傷具有多樣性，因而獲得的突變型也具有很大的多樣性[24]。

2.4 遺傳穩(wěn)定性結(jié)果

圖2 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性Fig.2 The hereditary stability of mutant strains

對(duì)復(fù)篩篩選出的C1、C2、C5和C12四株誘變效果較好的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2看出，C1誘變菌株中性蛋白酶酶活，在第1代到第5代的傳代過(guò)程中逐漸增大，但在后續(xù)傳代過(guò)程中顯著下降（p＜0.05）；C2菌株在傳代過(guò)程中，中性蛋白酶酶活力逐漸增加，從62.73 U/mL（第1代）上升到最大67.22 U/mL（第7代），在后續(xù)傳代過(guò)程中趨于穩(wěn)定；C5菌株中性蛋白酶酶活力，從第1代到第5代傳代過(guò)程中顯著提高（p＜0.05），從66.14 U/mL（第1代）上升到最大78.12 U/m（第5代），在后續(xù)傳代過(guò)程中趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)樵谡T變后，雖然菌體的基因有所改變，但并不一定能立即表現(xiàn)出來(lái)，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)型才逐漸顯現(xiàn)出來(lái)[25]。舒冬梅等[11]在對(duì)米曲酶進(jìn)行 ARTP誘變過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，在對(duì)誘變后篩選出的H15菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)定中，也得出中性蛋白酶酶活在傳到第9代時(shí)蛋白酶活力從1792.8 U/g上升到1816.3 U/g。C12誘變菌株穩(wěn)定性較好，中性蛋白酶酶活無(wú)顯著性變化（p＞0.05）。綜合考慮中性蛋白酶酶活和遺傳穩(wěn)定性?xún)蓚€(gè)因素，選取C5和C12兩種誘變菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5 SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

圖3 誘變菌株和初始菌株菌體蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoretograms of proteins from the mutant and original strains

對(duì)誘變菌株 C5、C12以及親本 Bacillus amyloliquefaciens 10160提取的菌體總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，經(jīng)過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)分析并拍照形成電泳圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，Bacillus amyloliquefaciens 10160經(jīng)過(guò)ARTP處理后，誘變菌株C5和C12與未處理的菌株條帶并沒(méi)有明顯的差異，僅在蛋白條帶的深淺上有差異，其中誘變處理的兩株菌蛋白條帶顏色加深，說(shuō)明誘變后蛋白濃度有所增加，推測(cè)可能是因?yàn)锳RTP在此誘變條件下產(chǎn)生的化學(xué)活性粒子，不足以引起菌體蛋白組成的改變，只是在某種程度上使菌體蛋白的表達(dá)量增加。該結(jié)果與吳平等[26]報(bào)道的結(jié)論一致，其利用SDS-PAGE電泳分析脈沖磁場(chǎng)處理對(duì)格式李斯特菌蛋白層面的影響研究中，也發(fā)現(xiàn)蛋白條帶未發(fā)生改變，只是條帶變深。

2.6 豆粕液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

將誘變菌株C5和C12與初始菌株用于豆粕液態(tài)發(fā)酵制備降血壓肽試驗(yàn)中，對(duì)發(fā)酵液離心取上清液，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

由表5可以看出，誘變后的菌株C5和C12經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，發(fā)酵上清液的多肽含量和得率與初始菌株發(fā)酵液相比顯著提高（p＜0.05）。這是因?yàn)檎T變后的菌株生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶酶活性比初始菌株高，所以在發(fā)酵過(guò)程中，分解豆粕蛋白產(chǎn)生的多肽含量和得率都有所提高。與初始菌株發(fā)酵液相比，菌株 C5發(fā)酵后多肽得率和含量分別提高了14.23%和15.56%；菌株C12發(fā)酵后多肽得率和含量分別提高了13.24%和11.77%。FAN等[9]用ARTP改善工程化枯草芽孢桿菌TD12np尿苷的生產(chǎn)量，通過(guò)建立的高通量篩選方法篩選出了一株突變體 F126，F(xiàn)126菌用于搖瓶發(fā)酵30 h和分批補(bǔ)料發(fā)酵48 h后，產(chǎn)生的尿苷含量比親本分別提高了4.4倍和8.7倍。同樣石琳等[27]通過(guò)傳統(tǒng)的紫外誘變紅曲霉，將初篩得到的高產(chǎn)蛋白酶菌株用于高溫豆粕發(fā)酵，以發(fā)酵產(chǎn)生的多肽含量為指標(biāo)，篩選出了一株高產(chǎn)可溶性多肽的突變菌株，該菌株在同等發(fā)酵條件下，產(chǎn)生的多肽含量是原始菌株的1.47倍。此外，C5和C12菌株發(fā)酵上清液的中性蛋白酶酶活也顯著提高（p＜0.05），分別增加了26.00%和29.84%，但是堿性蛋白酶酶活與初始菌株相比并沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）。從ACE抑制率看出，將C5、C12以及初始菌株發(fā)酵液多肽濃度稀釋到相同濃度（10 mg/mL）后，ACE抑制率無(wú)顯著差異（p＞0.05）。這可能是因?yàn)?ACE抑制肽活性與其氨基酸組成和氨基酸序列有著重要的聯(lián)系[28]，雖然誘變后菌體分泌的蛋白酶酶活增大，發(fā)酵產(chǎn)生的多肽含量提高，但是產(chǎn)生的多肽的氨基酸組成和序列及分子量分布并無(wú)明顯的差異。

表5 誘變菌株和初始菌株豆粕液態(tài)發(fā)酵結(jié)果Table 5 Results of soybean meal liquid fermentation from the mutant and original strains

表6 誘變菌株和初始菌株發(fā)酵上清液分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of fermentation supernatants from the mutant and original strains

表6列出了經(jīng)過(guò)ARTP誘變篩選得到的兩株菌以及初始菌株分別用于豆粕液態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵上清液的分子量分布情況。由表6可以看出，C5和C12兩株菌發(fā)酵上清液的分子量低于3000 u的小分子肽比例分別為85.37%和86.83%，與初始菌株（87.17%）相比，無(wú)明顯差異。這可能是因?yàn)殡m然誘變后的菌株酶活性有所提升，但是所分泌的酶的種類(lèi)并沒(méi)有改變，酶切位點(diǎn)未發(fā)生改變，致使酶解產(chǎn)生的小分子量段肽的肽鏈長(zhǎng)度未發(fā)生改變。雖然誘變菌株液態(tài)發(fā)酵后大分子量段肽含量有所增加，尤其是C5株菌發(fā)酵液，但是由于主要是低分子量多肽提供 ACE抑制活性，且活性更高[29]，所以該結(jié)果也為上述誘變后的菌株發(fā)酵上清液ACE抑制率沒(méi)有顯著性提高提供了理論依據(jù)。

3 結(jié)論

3.1 本文采用 ARTP對(duì) Bacillus amyloliquefaciens 10160進(jìn)行誘變處理，以致死率達(dá)到80%為考察指標(biāo)優(yōu)化獲得ARTP誘變的最佳條件為：功率100 W、通氣量10 L/min、處理時(shí)間10 s。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步菌株初篩和復(fù)篩，得到了C5和C12兩株穩(wěn)定遺傳的突變菌株，與初始菌株相比，中性蛋白酶酶活分別提高了86.03%和85.02%。并對(duì)菌株C5、C12以及初始菌株提取的菌體總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，誘變后蛋白條帶數(shù)并未發(fā)生變化，只是蛋白條帶變深，表明誘變對(duì)菌體蛋白組成并未產(chǎn)生顯著影響，僅是提高了蛋白濃度。

3.2 豆粕液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與初始菌株相比，誘變后發(fā)酵液中多肽含量和得率大大提高，菌株C5發(fā)酵后多肽得率和含量分別提高了14.23%和15.56%；菌株C12發(fā)酵后多肽得率和含量分別提高了13.24%和11.77%。誘變后發(fā)酵液中中性蛋白酶酶活也大大提高，菌株C5和C12發(fā)酵后中性蛋白酶酶活分別增加了26.00%和29.84%，但是堿性蛋白酶酶活并沒(méi)有明顯變化。菌株C5和C12發(fā)酵液分子量分布未發(fā)現(xiàn)改變，ACE抑制率未發(fā)生變化，由此得出 ARTP處理Bacillus amyloliquefaciens 10160可以顯著提高其豆粕液態(tài)發(fā)酵制備降血壓肽的產(chǎn)率。