郝月綽，林影，梁書利

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

皺褶假絲酵母(C. rugosa)，原稱柱狀假絲酵母(C.cylindracea)，是一種半子囊不產(chǎn)孢子的食品安全級(jí)酵母菌株[1]。皺褶假絲酵母脂肪酶(C. rugosa lipases，CRLs)主要由野生型菌株ATCC 14830和Type VII生產(chǎn)[1]，是目前應(yīng)用最為廣泛的商品化脂肪酶之一，在制藥、食品、化妝品和能源等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[2～5]。目前已知CRLs由8種同工酶組成，其中CRL1具有最高的表達(dá)量和酶活力[6～8]。不同商品酶之間由于CRLs的成分和比例不同，在催化效率、區(qū)域選擇性和立體選擇性上表現(xiàn)出顯著差異[9,10]。分離或生產(chǎn)單一的皺褶假絲酵母脂肪酶，尤其是 CRL1，對(duì)開(kāi)展CRLs的進(jìn)一步研究具有重要意義。

CRL1已經(jīng)被報(bào)道在畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)成功[8,11,12]。Brocca等[11]首次實(shí)現(xiàn)了CRL1在畢赤酵母的活性表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)對(duì)絲氨酸非通用密碼子的改造是重組 CRL1成功表達(dá)的關(guān)鍵。Chang等[13]和Xu等[12]分別通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化以及基因過(guò)表達(dá)的方法將CRL1在畢赤酵母的表達(dá)量進(jìn)一步提高，而關(guān)于啟動(dòng)子和分泌信號(hào)肽的系統(tǒng)優(yōu)化目前尚未報(bào)道。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，既具有原核表達(dá)系統(tǒng)易培養(yǎng)、繁殖快的優(yōu)點(diǎn)，又可對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工修飾。此外，畢赤酵母遺傳背景清晰、便于遺傳操作，擁有強(qiáng)大的啟動(dòng)子、能夠高效表達(dá)外源蛋白，適合高密度發(fā)酵且便于分離純化。作為模式菌株或工業(yè)生產(chǎn)菌株，目前已經(jīng)有超過(guò)5000種外源蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá)[14]。

維生素 E(生育酚)作為一種重要的保健藥品，具有抗衰老、抗不育、提高免疫力和預(yù)防心血管疾病等重要作用[15]。由于維生素E具有易氧化、表面活性差等缺點(diǎn)，目前的研究熱點(diǎn)主要集中在其酚羥基的改性上[16]。作為市場(chǎng)上最主要的維生素E衍生物產(chǎn)品，維生素E醋酸酯可用化學(xué)催化劑(三乙胺、HCl/ZnCl2等)催化D-α-生育酚與醋酸酐反應(yīng)得到[17～19]，但存在副產(chǎn)物多、污染環(huán)境、底物選擇性差和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低等缺陷。而生物酶法具有反應(yīng)條件溫和、高效、專一和清潔生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，隨著人們對(duì)食品安全和綠色食品的意識(shí)和要求不斷提高，開(kāi)發(fā)生物酶法催化合成維生素E醋酸酯具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)合啟動(dòng)子和分泌信號(hào)肽改造實(shí)現(xiàn)皺褶假絲酵母脂肪酶CRL1在畢赤酵母的高效表達(dá)。在蛋白純化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定了重組CRL1的酶學(xué)性質(zhì)；并建立無(wú)溶劑體系中重組CRL1催化合成維生素E醋酸酯的方法，為維生素E醋酸酯的高效合成及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因、菌株和質(zhì)粒

根據(jù)CRL1的蛋白序列(UniProt KB-P20261)，使用OptimumGeneTM對(duì)密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，并將其中19個(gè)非通用絲氨酸密碼子CTG轉(zhuǎn)化為通用絲氨酸密碼子TCT，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

大腸桿菌菌株Escherichia coli Top10和畢赤酵母菌株 P. pastoris GS115購(gòu)自 Invitrogen公司。質(zhì)粒pHKA和pHKA-AOXm/αm均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[20]。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

KOD酶購(gòu)自TOYOBO公司；T4DNA連接酶、DNA Marker和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自Magen公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自捷瑞生物工程有限公司；對(duì)硝基苯酚丁酯(pNPB)購(gòu)自Sigma公司；酵母抽提物購(gòu)自O(shè)xford公司；酵母氮源YNB和蛋白胨購(gòu)自Difco公司；87.25% D-α-生育酚購(gòu)自江蘇璽鑫維生素有限公司；95.50% D-α-生育酚和96.00% D-α-生育酚醋酯購(gòu)自Sigma公司；無(wú)水乙醇(色譜純)購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基(1 L)：5.0 g酵母抽提物，10.0 g蛋白胨，10.0 g氯化鈉；YPD培養(yǎng)基(1 L)：10.0 g酵母抽提物，20.0 g蛋白胨，20.0 g葡萄糖；BMGY培養(yǎng)基(1 L)：10.0 g酵母抽提物，20.0 g蛋白胨，13.4 g YNB，100 mL PBS (100 mmol/L，pH 6.0)緩沖液，10 mL甘油；BMMY培養(yǎng)基(1 L)：10.0 g酵母抽提物，20.0 g蛋白胨，13.4 g YNB，100 mL PBS (100 mmol/L，pH 6.0)緩沖液，10 mL甲醇；MD篩選平板(1 L)：13.4 g YNB，20.0 g葡萄糖，20.0 g瓊脂；三丁酸甘油酯乳化平板(1 L)：5.0 g硫酸銨，3.0 g酵母抽提物，20.0 g瓊脂，1.0 g PVA，2.0×10-4g生物素，5 mL三丁酸甘油酯，5 mL甲醇，100 mL PBS (100 mmol/L，pH 6.0)緩沖液。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；NanoDrop 1000超微量核酸蛋白測(cè)定儀，美國(guó) Thermo公司；5804R型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；萬(wàn)分之一分析天平，德國(guó)Satorius公司；ZWYR-D2402型恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；UV-2350型分光光度計(jì)，美國(guó)UNICO公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；KS 4000 i control型恒溫反應(yīng)搖床，德國(guó)IKA公司；7820A型氣相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 重組菌株構(gòu)建和發(fā)酵

以EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分別為上、下游酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成引物(上游引物為 CRL1-F：CCGGAATTCCATCATCATCATCATCATGCTCCAAC TGCTACTTTGGC；下游引物為 CRL1-S：ATTTGCGGCCGCTTAAACGAAAAAGGAT GGTGGGT)；以質(zhì)粒pGH-CRL1為模板，PCR擴(kuò)增CRL1基因序列。CRL1基因和質(zhì)粒載體 pHKA或pHKA-AOX1m/αm(AOX1啟動(dòng)子的改造參照 Hartner等[21]的方法，在原AOX1啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上引入一個(gè)順式作用原件；α分泌信號(hào)肽的改造參照Kjeldsen等[22]的方法，在原α分泌信號(hào)肽和多克隆位點(diǎn)之間引入一段10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的間隔肽)分別進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物純化回收后采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E. coli Top10感受態(tài)，涂布于含5 mg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定并送樣至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

重組質(zhì)粒 pHKA-CRL1或 pHKA-AOX1m/αm-CRL1經(jīng)Sal Ⅰ線性化后，電擊轉(zhuǎn)入P. pastoris GS115感受態(tài)中，涂布MD篩選平板，30 ℃培養(yǎng)72 h。挑取經(jīng)菌落 PCR鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子至三丁酸甘油酯乳化平板，30 ℃培養(yǎng)大約48 h。挑取產(chǎn)生水解圈直徑較大的單菌落至 YPD培養(yǎng)基進(jìn)行活化，然后接種BMGY培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)16～24 h至OD600為2.0～6.0。離心收集菌體，轉(zhuǎn)接BMMY培養(yǎng)基，控制起始OD600為1.0，30 ℃、250 r/min搖瓶培養(yǎng)120 h。發(fā)酵期間每隔24 h添加1%(V/V)甲醇，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)酶，同時(shí)取樣測(cè)定重組菌株生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵液中脂肪酶活力。

1.2.2 脂肪酶水解活力測(cè)定

采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶水解活力[23]。發(fā)酵液樣品經(jīng)14,000 r/min離心5 min，棄菌體。取50 μL適當(dāng)稀釋后的酶液，加入到裝有900 μL Tris-HCl (50 mmol/L，pH 8.0)緩沖液的2 mL離心管中，對(duì)照組為950 μL緩沖液，置于恒溫震蕩混勻儀45 ℃、800 r/min預(yù)熱5 min?？焖偌尤?0 μL對(duì)硝基苯酚丁酯乳化液，相同條件下反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后14,000 r/min離心1 min，取200 μL上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，每組設(shè)3個(gè)平行。一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘水解生成 1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。

1.2.3 酶蛋白純化

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液于4 ℃、14,000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)10,000 MWCO PES膜包超濾濃縮，濃縮液通過(guò)35%和85%飽和硫酸銨分段鹽析處理。蛋白沉淀復(fù)溶后用Buffer A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)緩沖液平衡的Sephadex G-25S柱進(jìn)行脫鹽操作，見(jiàn)峰收集。收集液再經(jīng)過(guò)Capto DEAE陰離子交換層析柱處理，Buffer B(在 Buffer A的條件下加入 500 mmol/L NaCl)溶液進(jìn)行梯度洗脫，收獲純化后的酶蛋白溶液。

采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，以小牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

最適溫度及溫度穩(wěn)定性：在 pH 8.0條件下，25 ℃～60 ℃溫度范圍內(nèi)測(cè)定酶活力，確定酶的最適溫度；酶液分別在40 ℃、50 ℃和60 ℃條件下水浴保溫，1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h取樣測(cè)定酶活力，考察酶的溫度穩(wěn)定性。

最適 pH及 pH穩(wěn)定性：在 45 ℃條件下，pH 6.0～10.0溫度范圍內(nèi)測(cè)定酶活力，確定酶的最適pH；酶液分別在pH 6.5、pH 7.0和pH 8.0條件下于45 ℃水浴保溫，1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h取樣測(cè)定酶活力，考察酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.5 CRL1催化劑制備

離心收集發(fā)酵上清液，于-80 ℃冰箱凍結(jié)6 h，再于0.37 Pa、-50 ℃條件下冷凍干燥18 h，收獲CRL1凍干酶粉，于4 ℃冰箱保存。使用時(shí)在裝有飽和MgCl2溶液的干燥器中平衡48 h后備用。

1.2.6 CRL1催化合成維生素E醋酸酯

稱取200 mg D-α-生育酚底物于10 mL具塞反應(yīng)瓶中，加入2 mL乙酸酐作為?；w，置于恒溫振蕩反應(yīng)器于40 ℃、200 r/min條件下預(yù)熱5 min，加入75 mg CRL1催化劑進(jìn)行催化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)14,000 r/min離心5 min，取上清用無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋后進(jìn)行氣相檢測(cè)。

1.2.7 氣相色譜檢測(cè)分析

色譜柱：J&W DB-17HT石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.15 μm)；升溫程序：100 ℃保持 1 min，以15 ℃/min升至280 ℃并保持1 min，再以5 ℃/min升至290 ℃并保持1 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃，檢測(cè)器(氫離子火焰檢測(cè)器)溫度 300 ℃，載氣(N2)流速 20 mL/min，分流比 40：1，進(jìn)樣體積 1 μL。

以95.50% D-α-生育酚為標(biāo)準(zhǔn)品建立質(zhì)量濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用外標(biāo)法對(duì)反應(yīng)體系中D-α-生育酚含量進(jìn)行定量分析。轉(zhuǎn)化率計(jì)算見(jiàn)公式（1）。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的構(gòu)建和平板篩選

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定(a)；重組菌株三丁酸甘油酯平板篩選(b，36 h)Fig.1 Identification of recombinant plasmid (a) and screening of recombinant strains on tributyrin agar plate(b)

以質(zhì)粒pGH-CRL1為模板，PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1600 bp左右的CRL1基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后插入到質(zhì)粒載體pHKA(或pHKA-AOX1m/αm)，然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli Top10進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pHKA-CRL1(或 pHKA-AOX1m/αm-CRL1)。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切鑒定，在1600 bp左右和7800 bp左右出現(xiàn)兩條條帶，分別與目的基因和質(zhì)粒載體大小相符(圖1a)。同時(shí)，重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的基因序列完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

重組質(zhì)粒線性化處理后電轉(zhuǎn)P. pastoris GS115，從MD篩選平板上挑選轉(zhuǎn)化子，使用5’AOX1上游通用引物和CRL1基因下游引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子條帶大小為1800 bp左右。

挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子至三丁酸甘油酯乳化平板進(jìn)行初篩(圖1b)，其中產(chǎn)生水解圈較早、直徑較大的單菌落可能具有較高的脂肪酶水解活力，從中選取3～5個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。

2.2 重組CRL1的表達(dá)和純化

2.2.1 重組CRL1的表達(dá)

圖2 CRL1重組菌株搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶特征曲線Fig.2 Curve of growth and lipase production of recombinant CRL1 strains in flask fermentation

重組菌株 GS115/pHKA-CRL1和 GS115/pHKAAOX1m/αm-CRL1的搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶特征曲線如圖2所示。從圖上看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩株重組菌株的菌體數(shù)量和脂肪酶活力都逐漸提高，并且在 120 h時(shí)分別達(dá)到最大值。重組菌株GS115/pHKA-CRL1在120 h時(shí)酶活力為39.73 U/mL，OD值為33.48。Li等[19]曾在畢赤酵母中分別對(duì)AOX1啟動(dòng)子和α信號(hào)肽進(jìn)行改造，將AOX1啟動(dòng)子的-230至-190區(qū)域的順式作用元件增加至二拷貝和刪除-777至-712區(qū)域，在α信號(hào)肽和多克隆位點(diǎn)之間增加可被信號(hào)肽切割識(shí)別的 10個(gè)氨基酸（EEAEAEAEPK），改造后重組植酸酶的表達(dá)水平分別提高了 35%和12%。本研究采用了相同方法對(duì)AOX1啟動(dòng)子和α信號(hào)肽同時(shí)進(jìn)行改造，改造后重組菌株GS115/pHKA-AOX1m/αm-CRL1的酶活力有明顯提高，最高水解活力達(dá)到63.63 U/mL，相對(duì)提高60.18%。此外，改造對(duì)重組菌株菌體生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯影響，OD600最高值為32.35，并且在整個(gè)過(guò)程中與重組菌株GS115/pHKA-CRL1的生長(zhǎng)趨勢(shì)保持一致，說(shuō)明利用該組合策略對(duì)CRL1重組菌株的改造較為成功。

2.2.2 重組CRL1的純化

重組菌株 GS115/pHKA-AOX1m/αm-CRL1搖瓶發(fā)酵120 h，離心收集粗酶液245 mL，酶活力為64.30 U/mL，然后按照方法1.2.3進(jìn)行酶蛋白純化。發(fā)酵液上清液首先經(jīng)過(guò)10,000 MWCO PES膜包超濾濃縮，可去除分子量小于 10 ku的雜蛋白，得到濃縮液 64 mL，比酶活提高了1.06倍，酶活力回收率為72.84%。隨后濃縮液通過(guò) 35%和 85%飽和硫酸銨分段鹽析處理，進(jìn)一步去除雜蛋白。蛋白復(fù)溶后利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)和Sephadex G-25S脫鹽柱進(jìn)行脫鹽操作，收集液中色素明顯減小，比酶活達(dá)到 604.76 U/mg。最后采用Capto DEAE陰離子交換層析柱對(duì)收集液進(jìn)一步純化，確定進(jìn)樣緩沖液最適pH為6.0，洗脫液分段洗脫梯度為150 mmol/L NaCl和200 mmol/L NaCl，在此條件下重組CRL1得到最佳效果。發(fā)酵液上清液經(jīng)過(guò)超濾濃縮、硫酸銨沉淀及脫鹽和陰離子交換層析三步純化，收集液中重組 CRL1的比酶活達(dá)到 984.52 U/mg，純化倍數(shù)5.41倍，酶活回收率33.81% (表1)。

將純化過(guò)程中收集到的重組 CRL1樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，可以看到，粗酶液經(jīng)過(guò)“超濾濃縮-硫酸銨沉淀后脫鹽-陰離子交換層析”三步純化后，雜蛋白逐步去除，在分子量60 ku附近得到單一的蛋白條帶，與預(yù)期相符，為重組CRL1目的條帶(圖3)。

表1 重組CRL1的蛋白純化Table 1 Purification of the recombinant CRL1

圖3 不同純化步驟后重組CRL1的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE patterns of recombinant CRL1 purified by different steps

2.3 重組CRL1的酶學(xué)性質(zhì)

根據(jù)方法1.2.4測(cè)定了溫度和pH對(duì)重組CRL1的影響。結(jié)果表明重組CRL1的最適溫度為40 ℃，在35 ℃和45 ℃時(shí)分別保留了66.85%和73.51%的相對(duì)活力(圖4a)。40 ℃、50 ℃和60 ℃時(shí)的半衰期分別為5 h、2 h和1 h左右，熱穩(wěn)定較差(圖4b)。重組CRL1的最適pH為7.5，在pH值7.0～8.0范圍內(nèi)酶活力維持在73.93%以上(圖4c)。在pH值6.5、7.0和8.0條件下經(jīng)45 ℃水浴保溫6 h，酶活力分別保留40.96%、26.35%和17.74%，在偏酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定(圖4d)。以上測(cè)定結(jié)果與Chang等[8]報(bào)道的基本一致，對(duì)CRL1的催化應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

2.4 CRL1催化合成維生素E醋酸酯

2.4.1 反應(yīng)溫度對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響

溫度是影響CRL1催化合成維生素E醋酸酯的主要影響因素，且主要影響反應(yīng)初速度，而對(duì)最終反應(yīng)平衡影響不大。在40 ℃、50 ℃和60 ℃條件下分別反應(yīng)30 h、15 h和9 h，D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到94.11%、95.58%和94.72%(圖5)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物轉(zhuǎn)化逐漸趨于完全，反應(yīng)36 h時(shí)40 ℃、50 ℃和60 ℃條件下的轉(zhuǎn)化率分別為 94.97%、97.37%和97.53%。后續(xù)利用CRL1催化合成維生素E醋酸酯的最適反應(yīng)溫度選定在60 ℃。

2.4.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響

搖床轉(zhuǎn)速通過(guò)影響反應(yīng)體系中的物質(zhì)和能量傳遞而影響維生素E醋酸酯的合成效果，較低的轉(zhuǎn)速不利于底物之間的充分接觸，而過(guò)高的轉(zhuǎn)速則會(huì)破壞底物分子之間的相互作用且浪費(fèi)能量。

圖4 重組CRL1酶學(xué)性質(zhì)Fig.4 Temperature effects on the activity

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on the synthesis of vitamin E acetate

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響Fig.6 Effect of shaking speed on the synthesis of vitamin E acetate

轉(zhuǎn)速主要影響反應(yīng)初速度，在100 r/min、200 r/min和300 r/min條件下分別進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)在大約12 h、9 h和15 h時(shí)分別達(dá)到平衡且D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率均為97.00%左右(圖6)。后續(xù)利用CRL1催化合成維生素E醋酸酯的最適搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，同時(shí)結(jié)合2.4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將最適反應(yīng)時(shí)間確定為9 h。

2.4.3 底物濃度對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響

圖7 底物濃度對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響Fig.7 Effect of substrate concentration on the synthesis of vitamin E acetate

控制D-α-生育酚含量一定，改變反應(yīng)體系中乙酸酐的添加量，考察了底物濃度對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響。反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間9 h。從結(jié)果中可以看到，隨著乙酸酐添加量的增加，D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率不斷提高，在乙酸酐添加量為1 mL時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大；之后繼續(xù)增加乙酸酐含量對(duì)D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率的提高沒(méi)有明顯影響，猜測(cè)可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系中酶與底物分子的結(jié)合達(dá)到了飽和狀態(tài)(圖7)。CRL1催化合成維生素E醋酸酯的最適底物濃度為1 mL乙酸酐/200 mg D-α-生育酚。

2.4.4 脂肪酶添加量對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響

圖8 脂肪酶添加量對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響Fig.8 Effect of lipase dosage on the synthesis of Vitamin E acetate

接下來(lái)，考察了脂肪酶添加量對(duì)維生素E醋酸酯合成的影響。反應(yīng)條件為：200 mg D-α-生育酚、1 mL乙酸酐、反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間9 h。隨著CRL1添加量從25 mg逐漸增加到100 mg，D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率從 57.42%逐漸提高到 97.62%；之后繼續(xù)增加CRL1添加量，D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率維持在97.00%左右，可能是因?yàn)樵摋l件下處于活躍狀態(tài)的底物分子已經(jīng)被過(guò)量的酶結(jié)合完全(圖8)。CRL1催化合成維生素E醋酸酯的最適脂肪酶添加量為100 mg。

截至目前，關(guān)于酶法合成維生素E醋酸酯的研究較少。Torres等[15]以Novozym 435為催化劑，在叔戊醇溶劑中催化 D-α-生育酚和乙酸乙烯酯轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成維生素E醋酸酯，連續(xù)反應(yīng)18 d，轉(zhuǎn)化率只有65%。龔等[24]以實(shí)驗(yàn)室自制固定化假絲酵母脂肪酶為催化劑，在石油醚溶劑中催化D-α-生育酚和乙酸乙烯酯轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成維生素E醋酸酯，轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%，但是反應(yīng)時(shí)間需要72 h，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)條件。本研究通過(guò)對(duì)無(wú)溶劑體系中重組CRL1催化合成維生素E醋酸酯的主要影響因素進(jìn)行逐步優(yōu)化，確定最適反應(yīng)條件為：200 mg D-α-生育酚、1 mL乙酸酐、100 mg CRL1、反應(yīng)溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、反應(yīng)時(shí)間9 h，D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到97.00%以上，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

皺褶假絲酵母脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用。本研究系統(tǒng)研究了皺褶假絲酵母脂肪酶CRL1在畢赤酵母中的表達(dá)、純化、酶學(xué)性質(zhì)以及催化應(yīng)用。通過(guò)對(duì)AOX1啟動(dòng)子和α分泌信號(hào)肽同時(shí)進(jìn)行改造，CRL1在畢赤酵母中的表達(dá)水平由39.73 U/mL提高到63.63 U/mL，相對(duì)提高60.18%。建立了超濾濃縮、硫酸銨沉淀后脫鹽和陰離子交換層析三步法純化重組CRL1的方法，純化后 CRL1的比酶活達(dá)到 984.52 U/mg。重組CRL1的最適溫度和最適pH分別為45 ℃和7.5，經(jīng)45 ℃保溫6 h仍保留52.99%的相對(duì)活力，在偏酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定。以重組CRL1為催化劑，建立并優(yōu)化了在無(wú)溶劑體系中高效合成維生素E醋酸酯的綠色方法，最適反應(yīng)條件為：200 mg D-α-生育酚、1 mL乙酸酐、100 mg CRL1、反應(yīng)溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、反應(yīng)時(shí)間9 h，D-α-生育酚的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到97.00%以上，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。