曾椿淋，朱琳，高鳳，俞冰倩，徐琴，楊賽，魏巍

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）（2.江蘇大學農(nóng)業(yè)裝備工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

奶酪又稱干酪，是動物乳經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸或不同風味的乳制品[1]。奶酪中的微生物分為發(fā)酵劑微生物和非發(fā)酵劑微生物兩種，這些微生物在蛋白質(zhì)凝固和獨特風味形成過程中發(fā)揮著決定性的作用[2]。發(fā)酵劑微生物包括標注于商品標簽上的人為添加已知微生物和源于原料奶及生產(chǎn)環(huán)境的未知微生物，它們將糖類等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機酸或分泌凝乳酶使蛋白質(zhì)凝固，也為后續(xù)微生物的生長及代謝創(chuàng)造適宜的環(huán)境[3]。非發(fā)酵劑微生物是除發(fā)酵劑微生物之外的微生物類群的統(tǒng)稱，其可以分泌種類繁多的蛋白酶降解酪蛋白和多肽，產(chǎn)生大量氨基酸，在奶酪成熟期獨特風味和質(zhì)構(gòu)的形成過程中發(fā)揮重要作用[4～6]。目前，人們對奶酪中微生物的研究主要集中在占據(jù)優(yōu)勢豐度的發(fā)酵劑微生物[7]，但對相對豐度較低的非發(fā)酵劑微生物的認知不足。

因此，全面解析奶酪樣品中微生物群落多樣性，比較不同種類奶酪樣品發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑微生物群落結(jié)構(gòu)差異，對解析奶酪蛋白質(zhì)凝固和風味質(zhì)構(gòu)形成具有重要的參考價值。

我國市場目前銷售的主要天然奶酪均為進口原酪，其商品標簽上均注明了人為添加的發(fā)酵劑微生物種類。由于天然奶酪存在成熟過程，造成奶酪表皮和內(nèi)部性質(zhì)不同[8]。盡管人們已經(jīng)明確了乳酸菌（LAB）類發(fā)酵劑微生物是天然奶酪中的主要微生物類群，但不同種類、不同部位天然奶酪微生物群落多樣性是否存在差異，天然奶酪中人為添加發(fā)酵劑微生物類群是否為該奶酪中的優(yōu)勢微生物類群，天然奶酪中是否還存在其它發(fā)酵劑微生物類群，以及天然奶酪中非發(fā)酵劑微生物類群的多樣性特征等問題，由于奶酪微生物研究方法的限制，仍尚未明確。

目前奶酪中微生物群落多樣性研究主要依靠的培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法（PLFA、PCR-DGGE和16SrRNA克隆文庫等）[9]，均難以確定奶酪微生物群落全貌，造成對奶酪內(nèi)微生物群落多樣性評價的偏差。近年來迅速發(fā)展的高通量測序技術(shù)，可以快速且準確獲得樣品中大多數(shù)微生物的多樣性信息[10]，為深度解析上述奶酪微生物群落的多樣性特征提供了可行的方法。

本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)，對不同天然軟質(zhì)奶酪樣品進行微生物群落結(jié)構(gòu)特征解析。通過對不同奶酪樣品中測序文庫的分析和對應(yīng)微生物物種的注釋，解析不同天然奶酪不同部位（表皮和內(nèi)部）的發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑微生物群落構(gòu)成和特征差異、探討天然奶酪樣品中發(fā)酵劑微生物可能的來源和非發(fā)酵劑微生物中發(fā)揮成熟作用的潛在類群。為進一步解析微生物與奶酪風味質(zhì)構(gòu)之間的關(guān)系提供有效的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時，凝乳酶使蛋白質(zhì)凝固，并經(jīng)進一步成熟而形成的具有也為發(fā)掘和分離奶酪中的微生物菌株資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究共采集江蘇地區(qū)市面主要銷售的5種不同進口天然軟質(zhì)成熟奶酪作為供試樣品，5種奶酪的生產(chǎn)工藝包括原料乳殺菌、接種發(fā)酵、凝乳、排除乳清、鹽浸、接種霉菌發(fā)酵劑和成熟等工序[11～13]，各奶酪成熟的環(huán)境根據(jù)制作工廠的不同而各不相同。所有樣品均購自鎮(zhèn)江市歐尚超市，未開封樣品購回后置于4 ℃冰箱保存，以用于后續(xù)試驗分析。樣品具體信息如下：

M牌卡門培爾奶酪，已標注的人為添加發(fā)酵劑微生物為：乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus.lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌雙乙酰亞種(Lc.lactis subsp.cremoris)。該奶酪樣品設(shè)置表皮(MCr)和內(nèi)部(MC)兩個處理；

M牌布里奶酪，已標注的人為添加發(fā)酵劑微生物為：乳酸乳球菌乳脂亞種(Lc.lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌雙乙酰亞種(Lc.lactis subsp.cremoris)。該奶酪樣品設(shè)置表皮(MBr)和內(nèi)部(MB)兩個處理；

B牌小布里奶酪，已標注的人為添加發(fā)酵劑微生物為：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)和白青霉菌(Penicillium candidum)。該奶酪樣品設(shè)置表皮(BPr)和內(nèi)部(BP)兩個處理；

B牌布里布蘭奶酪，已標注的人為添加發(fā)酵劑微生物為：嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)、嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)、白青霉菌(P.candidum)和洛克福青霉(P.roqueforti)。該奶酪樣品設(shè)置表皮(BBr)和內(nèi)部(BB)兩個處理；

P牌卡門培爾奶酪，已標注的人為添加發(fā)酵劑微生物為：乳酸乳球菌乳脂亞種(S.thermophilus)、乳酸乳球菌雙乙酰亞種(Lc.lactis subsp.cremoris)和白青霉菌(P.candidum)。該奶酪樣品設(shè)置表皮(PCr)和內(nèi)部(PC)兩個處理。研究用的試劑和試劑盒包括：Power Food Microbial DNA Isolation Kit試劑盒，美國Mobio公司；HS Taq酶，Takara試劑公司；KOD SYBR qPCR Mix試劑盒，東洋紡公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MP*FastPrep-24樣品處理系統(tǒng)，美國安倍醫(yī)療(MP Biomedicals)公司；電子天平，上海精科天平儀器廠；高速冷凍離心機，德國艾本德(Eppendorf)公司；PCR儀，美國Thermo公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 奶酪樣品微生物總DNA提取及PCR擴增

奶酪樣品總DNA提取參考Power Food Microbial DNA Isolation Kit試劑盒說明書。取樣方式參考郭善廣等[12]的方法，以天然奶酪最外緣向內(nèi)7 mm作為表皮，其余部分作為內(nèi)部。

以提取到的樣品總 DNA為模板，對細菌 16S rDNA的V4區(qū)對應(yīng)的DNA序列進行PCR擴增。以通用引物 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌 16S rDNA的V4區(qū)域進行擴增[14]。采用Takara試劑公司的HS Taq酶進行PCR擴增，PCR擴增體系為：Buffer 2.5 μL、Mg2+(25 mmol/L) 2 μL、dNTP 2 μL、Primer F (515F)0.5 μL、Primer R (806R) 0.5 μL、BSA (5 mg/mL) 2.5 μL、Taq酶0.1 μL、DNA模板1 μL、加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[14]。PCR擴增反應(yīng)完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳檢測，若在300 bp左右處出現(xiàn)清晰無拖尾無彌散現(xiàn)象的條帶，則說明擴增成功。

1.3.2 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

將PCR擴增到的奶酪樣品細菌16S rDNA委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司在 Illumina-HiSeq平臺上進行高通量測序，分析奶酪樣品細菌群落多樣性。對高通量測序初始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，以獲得更為精準、高質(zhì)量的DNA序列信息，采用Mothur軟件將得到的 16S rDNA基因序列在 RDP (ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫中進行嵌合體檢驗，充分去除嵌合體序列。為了得到每個 OTU(Operational Taxonomic Unit)對應(yīng)的物種分類信息，采用 RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，用 Mothur軟件構(gòu)建稀釋性曲線[15]。然后基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs聚類和物種分類分析，并將 OTU和物種注釋結(jié)合，從而得到每個樣品的OTUs 和分類譜系的基本分析結(jié)果。再對OTUs進行豐度、多樣性指數(shù)等分析，利用QIIME軟件計算樣品Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)[15～17]。在以上分析的基礎(chǔ)上，進行一系列 OTUs、物種組成聚類分析與PCoA分析，挖掘樣品之間物種組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同奶酪樣品細菌群落的高通量測序文庫評價

圖1 細菌群落高通量測序文庫稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of bacterial high-throughput sequencing library

根據(jù)細菌16S rDNA高通量測序文庫的稀釋曲線(圖1)，當測序序列超過50000條時，雖然仍然有新的OTU被發(fā)現(xiàn)，但是稀釋曲線趨于平緩，達到平臺期，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的 OTU以及新得注釋物種，該文庫的測序結(jié)果已經(jīng)基本能夠代表樣品細菌群落的組成。計算所有10個測序文庫的覆蓋率均超過99%(表1)。因此，10個樣品的測序文庫趨于飽和，測序結(jié)果可以用于后續(xù)的生物信息學分析。

根據(jù)奶酪樣品高通量測序文庫質(zhì)量匯總表(表1)，10個樣品獲得有效序列數(shù)量均超過50000條，可操縱分類單元(OTU)數(shù)量為118～646之間。Chao1指數(shù)是群落微生物的豐度指數(shù)，主要反映生態(tài)系統(tǒng)中物種的數(shù)目，其值越高表明群落物種的豐度越高；Shannon指數(shù)主要反映群落種數(shù)和各種間個體分配的均勻性，各種之間，個體分配越均勻，該指數(shù)就越大；Simpson指數(shù)具體表示的是在一個群落中隨機取樣的兩個個體屬于不同種的概率，該指數(shù)不會超過 1，且越大，表示該群落物種多樣性越大。綜合比較各個樣品 OTU數(shù)量、Chao 1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)，發(fā)現(xiàn)除M牌布里奶酪和B牌布里布蘭奶酪樣品外，其它樣品表皮比內(nèi)部均具有更高的OTU數(shù)量、Chao 1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)，說明天然奶酪表皮的細菌種豐富度普遍高于內(nèi)部。

2.2 OTU水平上天然奶酪不同部位細菌群落特征差異

韋恩圖用于表示多個組共有和特有OTU的情況。從圖2可以看出，5種奶酪樣品表皮的OTU總數(shù)為2251，內(nèi)部的OTU總數(shù)為2289，對5種奶酪的表皮和內(nèi)部分別進行基于OTU的韋恩分析，發(fā)現(xiàn)5種奶酪表皮的具有51個共有OTU，占表皮OTU總數(shù)的2.3%；內(nèi)部具有 121個共有 OTU，占 OTU總數(shù)的5.3%。各個樣品表皮特有OTU數(shù)為21、54、62、142、148，P牌卡門培爾奶酪表皮的特有OTU數(shù)最多。各個樣品內(nèi)部特有OTU數(shù)為38、45、63、76、137，B牌小布里奶酪內(nèi)部的特有OTU數(shù)最多。

表1 奶酪樣品高通量測序文庫信息匯總Table 1 Summary of the bacterial high-throughput sequencing library of all cheese samples

圖2 不同天然奶酪表皮細菌OTU韋恩圖（a），內(nèi)部細菌OTU韋恩圖（b）Fig.2 Venn figure of bacterial OTU from the rind (a) and core(b) of all cheese samples

為進一步對每個樣品的群落結(jié)構(gòu)差異進行分析，對樣品進行基于UniFrac的加權(quán)的主坐標分析。即應(yīng)用Unifrac方法將所有處理細菌OTU進行加權(quán)的聚類分析，即在考慮 OTU序列的數(shù)量和進化關(guān)系的基礎(chǔ)上，計算各個樣品間的距離矩陣，再對上述距離矩陣進行降維分析，結(jié)果如圖3所示?；赨niFrac的加權(quán)的主坐標分析其第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為52.79%和29.18%，除PC樣品外，各個樣品表皮和內(nèi)部之間主成分距離較大，而所有樣品內(nèi)部聚成一組，表皮各自分開。該結(jié)果說明天然奶酪表皮和內(nèi)部之間細菌群落構(gòu)成差異較大。同時，不同天然奶酪的表皮之間細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，不同天然奶酪內(nèi)部之間細菌群落組成結(jié)構(gòu)相似。

圖3 不同奶酪樣品細菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標分析Fig.3 Principal Co-ordinates Analysis of bacterial community of all cheese samples

2.3 不同奶酪樣品發(fā)酵劑細菌和非發(fā)酵劑細菌的物種注釋及分布特征

對所有OTU序列進行物種注釋，共得到414個不同的細菌屬。其中，各個處理中相對豐度所占比例排名前十(TOP10)細菌屬的相對豐度總和超過了總數(shù)的90%。對各處理中的TOP10的細菌屬組成(圖4)進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，5種天然奶酪的表皮和內(nèi)部最優(yōu)勢的細菌菌屬均為發(fā)酵劑微生物所在的屬，即乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)，相對豐度占細菌總豐度的 51～97%之間。M牌不同種類奶酪的表皮和內(nèi)部最優(yōu)勢細菌屬均為乳球菌屬(Lactococcus)。其中，MC奶酪的表皮和內(nèi)部乳球菌屬相對豐度分別為 63.55%和 91.94%，MB奶酪的表皮和內(nèi)部乳球菌屬相對豐度分別為 84.48%和91.20%。B牌不同種類奶酪的最優(yōu)勢細菌屬并不相同，BP奶酪表皮和內(nèi)部最優(yōu)勢細菌屬均為乳球菌屬(Lactococcus)，相對豐度分別為48.30%和75.82%；BB奶酪表皮和內(nèi)部最優(yōu)勢細菌屬均為乳桿菌屬(Lactobacillus)，相對豐度分別為77.23%和68.83%。P牌奶酪的表皮和內(nèi)部最優(yōu)勢細菌屬均為鏈球菌屬(Streptococcus)，PC奶酪表皮和內(nèi)部鏈球菌屬的相對豐度分別為82.24%和87.40%。所有樣品表皮和內(nèi)部最優(yōu)勢的菌屬均為同一細菌屬。

除人為添加發(fā)酵劑細菌屬之外，所有的樣品中均存在的其它發(fā)酵劑細菌屬。MC奶酪中人為添加乳球菌屬，還存在鏈球菌屬(表皮1.71%，內(nèi)部1.24%)和乳桿菌屬(表皮1.38%，內(nèi)部0.97%)。MB奶酪中人為添加乳球菌屬，還存在鏈球菌屬(表皮0.42%，內(nèi)部1.52%)和乳桿菌屬(表皮0.09%，內(nèi)部0.74%)。BP奶酪中人為添加鏈球菌屬和乳桿菌屬，還存在乳球菌屬(表皮48.28%，內(nèi)部75.74%)。BB奶酪中人為添加鏈球菌屬和乳桿菌屬，還存在乳球菌屬(表皮 1.59%，內(nèi)部2.75%)。PC奶酪中人為添加乳球菌屬，還存在鏈球菌屬(表皮 82.19%，內(nèi)部 87.40%)和乳桿菌屬(表皮0.91%，內(nèi)部 0.54%)。這些發(fā)酵劑細菌可能來自原料奶或者制作奶酪的環(huán)境。同時，樣品中最優(yōu)勢的并不一定是商品標注的人為添加的微生物，例如BP處理(B牌小布里奶酪)中添加了嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和白青霉菌，但其最優(yōu)勢的細菌屬為乳球菌屬；PC處理(P牌卡門培爾奶酪)中添加了乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種和白青霉菌，但其最優(yōu)勢的細菌屬為鏈球菌屬。

10個樣品中排名前 10的非發(fā)酵劑細菌屬有Helicobacter屬、Actinobacillus屬、Sphingomonas屬、Thermus屬、Acinetobacter屬、Campylobacter屬。MC奶酪中最優(yōu)勢的非發(fā)酵劑細菌屬為Thermus屬（表皮0.30%，內(nèi)部0.36%）；MB奶酪中最優(yōu)勢的非發(fā)酵劑細菌屬為Thermus屬（表皮0.17%，內(nèi)部0.99%）；BP奶酪表皮中最優(yōu)勢的非發(fā)酵劑屬為 Thermus屬（0.46%），內(nèi)部最優(yōu)勢的非發(fā)酵劑屬為Sphingomonas屬（4.11%）；BB奶酪中最優(yōu)勢的非發(fā)酵劑屬為Acinetobacter屬（表皮0.03%，內(nèi)部0.04%）；PC奶酪中最優(yōu)勢的非發(fā)酵劑屬為Thermus屬（表皮0.69%，內(nèi)部2.22%）。除BP奶酪以外，其余奶酪樣品表皮和內(nèi)部最優(yōu)勢的非發(fā)酵劑細菌屬為同一菌屬。

圖4 不同奶酪樣品TOP10的優(yōu)勢細菌屬相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial genus at TOP10 level from all cheese samples

圖5 不同奶酪樣品TOP35的細菌屬相對豐度及聚類分布熱圖Fig.5 Heatmap of bacterial genus at TOP35 level from all cheese samples

進一步對各處理的TOP35細菌屬進行研究，繪制其相對豐度熱圖(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了少數(shù)分布在厚壁菌門(Firmicutes)的幾個發(fā)酵劑微生物細菌所在屬外，其余細菌屬均為非發(fā)酵劑微生物所在的屬，分布于細菌的厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)和軟壁菌門(Tenericutes)。熱圖可以通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上同一門類的相對豐度差異，從而體現(xiàn)各分類水平上群落組成的相似性和差異性。通過比較10個奶酪樣品各個屬相對豐度熱圖，發(fā)現(xiàn)不同進口奶酪之間發(fā)酵劑細菌所在的屬相對豐度存在差異，如BBr和BB樣品中Lactobacillus屬相對豐度明顯高于該屬在其他樣品中的相對豐度，PCr和PC樣品中鏈球菌Streptococcus屬相對豐度明顯高于該屬在其他樣品中的相對豐度。有一些非發(fā)酵劑細菌所在的屬相對豐度也存在明顯差異，如MC樣品中的非發(fā)酵劑細菌屬 Acidithiobacillus屬，BPr樣品中Pseudomonas屬，BP樣品中Thermus屬、Rhodococcus屬、Leuconostoc屬、Natronomonas屬、Sphingomonas屬、Bradyrhizobium屬的相對豐度明顯不同于這些屬在其他樣品中的相對豐度。

3 討論

3.1 本研究較已報道的分離培養(yǎng)的方法獲得了更多關(guān)于奶酪中細菌群落結(jié)構(gòu)信息。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法的工作量大耗時長，又因培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的限制，使得檢出的奶酪中微生物種類受限且無法獲得種群結(jié)構(gòu)，造成對奶酪內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)評價的偏差。目前，通過培養(yǎng)法從奶酪中分離出的細菌主要集中在優(yōu)勢性較強的乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳球菌、明串珠菌、腸球菌、片球菌等發(fā)酵劑與非發(fā)酵劑細菌屬[18～22]。而本研究利用高通量測序的方法，亦獲得了上述已分離到的微生物屬，這些屬在各個樣品中的相對比例為5.5%～93.3%，同時還獲得了分屬于厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、異常球菌-棲熱菌門和軟壁菌門等6個門的60個綱、112個目、196個科的407個不同的非發(fā)酵劑細菌屬，相對豐度為2.7%～47.5%。這些詳細而全面的數(shù)據(jù)為后期研究微生物與奶酪風味質(zhì)構(gòu)的關(guān)系提供了有效的基礎(chǔ)信息。

3.2 在本研究中，主坐標分析結(jié)果顯示同一種類天然奶酪的不同部位、不同種類天然奶酪表皮之間細菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，而不同品牌天然內(nèi)部之間細菌群落結(jié)構(gòu)相似。影響食品中微生物生長繁殖的因素包括溫度、pH、水分、滲透壓、氧氣等理化因素，以及原料奶的動物來源、添加的原料、原料奶是否采用巴氏殺菌技術(shù)、奶酪中原料奶中自帶的微生物和奶酪的酸化過程等加工工藝因素[23～25]。同一種奶酪的加工工藝條件相同，但是其不同部位的水分、滲透壓等理化因素存在差異，所以同一天然奶酪表皮和內(nèi)部細菌群落結(jié)構(gòu)不同，很有可能是理化性質(zhì)不同造成的。此外，奶酪皮暴露在外部環(huán)境中接觸到了內(nèi)部接觸不到的菌，也有可能造成表皮和內(nèi)部的細菌群落結(jié)構(gòu)不一致[26]。但是不同品牌天然內(nèi)部之間細菌群落結(jié)構(gòu)相似，說明了更有可能是外界環(huán)境造成了天然奶酪表皮和內(nèi)部細菌群落結(jié)構(gòu)不一致。這一推測正確與否，還需要后續(xù)更深入的研究加以驗證。

3.3 物種注釋的結(jié)果表明，天然奶酪中存在的發(fā)酵劑細菌屬為乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等，這些細菌屬也常常出現(xiàn)在其他奶酪和酸奶等發(fā)酵乳制品中[18,27,28]。通過分離培養(yǎng)的方法，就可以鑒定這些發(fā)酵劑細菌屬。但高通量測序技術(shù)在鑒定出這些細菌屬的同時，還可以對這些屬的豐度進行比較，從而獲得一些只進行物種注釋研究不能得到的發(fā)現(xiàn)。通過對發(fā)酵劑細菌屬的豐度進行比較，我們發(fā)現(xiàn)，即使天然奶酪中人工添加了大量發(fā)酵劑細菌，但是每個奶酪樣品中除了有人工添加發(fā)酵劑細菌外，還有來自原料或者奶酪制作環(huán)境的發(fā)酵劑細菌，且在最后的奶酪商品中人工添加發(fā)酵劑細菌不一定是最優(yōu)勢菌屬。如PC奶酪樣品中的最優(yōu)勢細菌屬是鏈球菌屬而不是人工加入的乳球菌屬，BP樣品中人工加入的細菌屬是鏈球菌屬和乳桿菌屬，但其最優(yōu)勢細菌屬卻是乳球菌屬。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是奶酪在制作過程中，pH值和含水率均下降，理化性質(zhì)發(fā)生了變化，食物環(huán)境發(fā)生了轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致奶酪中存在的微生物群體的選擇[29]。外界環(huán)境因素如溫度和相對濕度也影響奶酪生產(chǎn)和成熟期間微生物多樣性的演變[30]。此外，加入的微生物同原料奶以及奶酪制作環(huán)境中的微生物相互影響，也有可能造成奶酪成品中人工加入的細菌不是最后奶酪商品中最優(yōu)勢的細菌。奶酪中微生物的變化是一個動態(tài)過程[31]，把不同時期奶酪的微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)及環(huán)境因素結(jié)合起來研究，將更好地揭示奶酪制作過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替方向。

3.4 除了發(fā)酵劑細菌屬之外，天然奶酪樣品中還存在大量的其他非發(fā)酵劑細菌屬。TOP35屬中的Halomonas屬是一類能在絕對鹽度(NaCl)為(0～32)%條件下生長的耐鹽細菌，該屬為亮氨酸氨肽酶陽性且能夠利用 DL-乳酸[32]；Rhodococcus屬中的不透明紅球菌可以產(chǎn)谷氨酸氧化酶，能氧化 L-谷氨酸生成 α-酮戊二酸(α-KG)、NH3和 H2O2[33]；Pseudomonas屬含有mgl序列，mgl序列編碼甲硫氨酸-γ-裂合酶(MGL)將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫醇，這一反應(yīng)是奶酪中硫化物形成的關(guān)鍵步驟[34]；Acetobacter屬可以發(fā)酵糖類產(chǎn)生醋酸；Atopostipes屬可以產(chǎn)生半胱氨酸蛋白酶；Turicibacter屬可以產(chǎn)生Lon蛋白酶； Thermus屬、Acidithiobacillus屬可以產(chǎn)絲氨酸蛋白酶。這些微生物類群多屬于目前尚未被廣泛明確認知的微生物類群，都可能對奶酪的成熟、風味質(zhì)構(gòu)形成具有至關(guān)重要的作用。通過比較各個屬相對豐度，分析非發(fā)酵劑細菌屬在不同樣品中的存在情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MC樣品中的非發(fā)酵劑細菌屬 Acidithiobacillus屬，BPr樣品中Pseudomonas屬，BP樣品中Thermus屬、Rhodococcus屬、Leuconostoc屬、Natronomonas屬、Sphingomonas屬、Bradyrhizobium屬的的相對豐度明顯高于這些屬在其他樣品中的相對豐度。猜測上述細菌屬可能與MC、BP奶酪樣品的某種特異性風味的形成有關(guān)。在TOP35的屬中出現(xiàn)了不可分類微生物unidentified_Mitochondria，其相對豐度在0.1%～40.4%，B牌小布里奶酪中該序列相對豐度最高。由于測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中序列不匹配或相似度不夠閾值，這些序列被歸為不可分類的微生物。但QUIGLEY[23]等人在愛爾蘭手工奶酪中亦檢測到了unidentified_Mitochondria的存在，經(jīng)過他們對該序列的進一步檢查，發(fā)現(xiàn)這段序列對應(yīng)于青霉屬的線粒體16S RNA基因。鑒于unidentified_Mitochondria較高的相對豐度以及B牌小布里奶酪加工過程中添加了青霉屬，我們推測這段序列很有可能也是來自青霉屬的線粒體16S RNA基因。

3.5 此外，利用高通量測序技術(shù)也得到了更多的、之前技術(shù)不能檢測但具有潛在功能的微生物類群。比如，在 10個樣品中發(fā)現(xiàn)了之前未報道過在奶酪中存在的棲熱菌屬(Thermus)，且該屬在 10個樣品的相對豐度均超過了0.02%。棲熱菌是耐高溫細菌，主要分布在水熱環(huán)境如溫泉、海底火山口、熱水管道以及自熱堆肥等地[35]，其最適生長溫度為 70 ℃～72 ℃，最高生長溫度為 79 ℃，最低生長溫度為 40 ℃[36]，有些奶酪加工時溫度能達到 50 ℃，達到該菌生長要求。張敏愛等[37]用16S rDNA克隆文庫法分析生鮮牛乳中細菌種群的多樣性，在鮮牛乳中也發(fā)現(xiàn)了棲熱菌屬的存在。因此，可以推測奶酪商品中的棲熱菌屬可能來自制作奶酪的原料乳。有研究表明棲熱菌屬可以產(chǎn)生耐熱的乳糖酶[38]，該屬極有可能是一種可以應(yīng)用于奶酪加工或者高溫條件下發(fā)酵乳糖相關(guān)工業(yè)的微生物資源。由此可見，擁有龐大的數(shù)據(jù)量以及測序深度的高通量測序是分析奶酪中占少數(shù)的難以分離檢測的非發(fā)酵劑微生物多樣性，以及挖掘具有潛在功能微生物的有力工具。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用Illumina-HiSeq高通量測序技術(shù)，解析了不同進口天然奶酪表皮和內(nèi)部的發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑細菌的群落結(jié)構(gòu)差異和多樣性組成。實驗結(jié)果表明，天然奶酪表皮普遍較其內(nèi)部具有更高的細菌群落豐富度，且天然奶酪表皮和內(nèi)部細菌群落具有明顯不同的結(jié)構(gòu)組成，說明外界環(huán)境可能對天然奶酪表皮的微生物群落產(chǎn)生了影響。天然奶酪的發(fā)酵劑細菌屬為乳球菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬，相對豐度在51%～97%，且奶酪制作過程中人為大量加入的發(fā)酵劑細菌屬不一定是奶酪商品中最優(yōu)勢的細菌屬；非發(fā)酵劑微生物分布于細菌厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、異常球菌-棲熱菌門和軟壁菌門，相對豐度在(2～16)%，許多非發(fā)酵劑細菌具有發(fā)酵糖類、利用乳酸以及產(chǎn)蛋白酶等功能，對奶酪風味質(zhì)構(gòu)的形成有重要作用。之前未在奶酪中被報道的Thermus屬的發(fā)現(xiàn)，也為發(fā)掘和分離奶酪中的食源性微生物資源奠定了基礎(chǔ)。