吳穎，崔彬淯，王露，稅何睿智，李凱

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418）

（2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

目前天然美白化妝品市場(chǎng)日趨活躍，其產(chǎn)品銷(xiāo)售與日俱增，已成為美白護(hù)膚化妝品的主流品種之一[1]。美白類(lèi)產(chǎn)品中可使用的美白功效成分種類(lèi)較多，但在市場(chǎng)中應(yīng)用廣泛的品種并不多，除熊果苷、煙酰胺、鞣花酸和Vc衍生物等美白劑外[2]，常用于商品化的天然高效美白物質(zhì)更是屈指可數(shù)，如有報(bào)道光果甘草根提取物、牡丹根提取物和茶葉提取物具有高效美白功效。因此，日化行業(yè)急需開(kāi)發(fā)天然安全高效的美白功效物質(zhì)。美白功效物質(zhì)就是作用于皮膚黑色素生成、代謝過(guò)程中抑制黑色素生成且符合規(guī)范的物質(zhì)。決定人體皮膚顏色的主要因素是黑色素的含量及分布，開(kāi)發(fā)美白功效物質(zhì)應(yīng)建立在對(duì)美白機(jī)理深入了解的基礎(chǔ)上，而抑制皮膚黑色素是美白作用機(jī)理的中心。在黑色素合成的速率控制階段，酪氨酸酶是其最主要限速酶[3]，通過(guò)抑制酪氨酸酶活性，可以減少黑色素的形成而達(dá)到美白的功效。因此，可通過(guò)測(cè)定酪氨酸酶活性抑制效果來(lái)作為評(píng)價(jià)物質(zhì)美白效果的指標(biāo)。目前，目前雖有文獻(xiàn)報(bào)道研究天然植物提取物抑制酪氨酸酶的活性和抗氧化能力，或者植物提取物的抗氧化能力與黃酮、總酚含量[4~6]，但關(guān)于提取物對(duì)酪氨酸酶的活性作用，以及抗氧化性、黃酮和總酚含量三者間關(guān)系的研究卻少有報(bào)道，也無(wú)較明確的結(jié)論。而且，文獻(xiàn)所采用的抗氧化方法一般只涉及一種或兩種，不同抗氧化方法所得的結(jié)果也不盡相同。因此，本文以桔梗、金盞菊、蒲公英、銀杏葉和茶葉5種植物為研究對(duì)象，研究其對(duì)酪氨酸酶抑制作用、抗氧化能力及黃酮和總酚含量，對(duì)三者之間進(jìn)行相關(guān)性分析，研究結(jié)果可為今后天然美白原料的篩選提供更多理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桔梗、金盞菊、蒲公英、銀杏葉、茶葉，上海人和堂國(guó)藥總店；新鮮馬鈴薯，市售；硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林試劑，上海寶曼生物科技有限公司；L-多巴、過(guò)硫酸鉀、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、硝酸鋁，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器

722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；JP-300B-6D型粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDZ4A-WS型離心機(jī)，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 天然產(chǎn)物醇提物的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g干燥后的天然產(chǎn)物粉末，加入100 mL、75%（V/V）的乙醇溶液，回流提取2 h，趁熱抽濾，棄去濾渣，加熱濃縮定容至100 mL，則醇提物濃度為4.0 mg/mL[7]。

1.3.2 酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取醇提物1 mL，酪氨酸酶液0.5 mL，加pH=6.0的磷酸緩沖液至4 mL，于室溫下靜置10 min后，加入0.015 mol/L多巴溶液1 mL混勻，靜置10 min后，以pH=6.0的磷酸緩沖液為參比，在475 nm處測(cè)定吸光度，以熊果苷作為對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，抑制率計(jì)算公式如下：

其中，A為有酪氨酸酶但沒(méi)有醇提物；B為無(wú)酪氨酸酶液也無(wú)醇提物；C為既有酪氨酸酶液也有醇提物；D為有醇提物但沒(méi)有酪氨酸酶。

1.3.3 抗氧化性能檢測(cè)

1.3.3.1 ABTS+清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]方法，將ABTS+溶液用磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）稀釋?zhuān)蛊湓?34 nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.700±0.020，即得到ABTS+工作液。

分別取1 mL一定濃度的醇提物至試管中，加入ABTS+工作液 3 mL，充分混合均勻，室溫避光保存10 min，在734 nm處測(cè)定吸光度（磷酸緩沖液為空白對(duì)照），以Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，清除率計(jì)算公式如下：

其中，Ai為1 mL樣品溶液+3 mL ABTS+溶液的吸光度值；Aj為1 mL樣品溶液+3 mL磷酸緩沖液的吸光度值；Ac為1 mL磷酸緩沖液+3 mL ABTS+溶液的吸光度值。1.3.3.2 DPPH+清除能力的測(cè)定

在2 mL 0.16 mmol/L DPPH的乙醇溶液中加入2 mL一定濃度的醇提物，混合均勻，室溫下避光放置40 min，用分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（無(wú)水乙醇為空白對(duì)照），以Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，清除率計(jì)算公式如下：

其中，Ai為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度值；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度值；Ac為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3.3 羥自由基清除能力測(cè)定

在0.40 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液中，加入1 mL 8.8 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液，再加入1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液和1.60 mL蒸餾水，混合均勻，37 ℃下水浴加熱15 min（蒸餾水為空白對(duì)照），在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值 Ac。Ai為以一定濃度的醇提物代替1.60 mL蒸餾水測(cè)得的吸光度值，取1 mL蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液測(cè)定吸光度值為Aj。以Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，計(jì)算樣品對(duì)羥自由基的清除率。

1.3.3.4 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

向1.40 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L，pH 8.2）中加入1 mL蒸餾水，再加入0.2 mL 5 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混合均勻，靜置5 min后在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)c。

Ai為以一定濃度的醇提物代替1 mL蒸餾水測(cè)得的吸光度值，取0.2 mL 10 mmol/L鹽酸溶液代替鄰苯三酚溶液測(cè)定吸光度值為Aj。以Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率[8]。

1.3.4 黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mL至試管中，加30%乙醇至5 mL，再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻靜置6 min，再加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，混勻靜置6 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL，最后加入30%乙醇0.4 mL，靜置15 min。以30%乙醇為空白對(duì)照，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[5]。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.0064C+0.0189，R2=0.9997。

準(zhǔn)確吸取一定濃度的醇提物 2 mL，按照上述方法，以30%乙醇為空白對(duì)照，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的黃酮含量，平行測(cè)定3次，取平均值。

1.3.5 總酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取 0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至試管中，加6 mL蒸餾水，搖勻，再加入0.5 mL福林試劑，混合均勻，1 min后加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，加蒸餾水至10 mL。反應(yīng)10 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.0852C+0.0089，R2=0.9984。

準(zhǔn)確吸取一定濃度的醇提物 2 mL，按照上述方法，以蒸餾水為空白對(duì)照，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的總酚含量，平行測(cè)定3次，取平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值，數(shù)據(jù)處理采用WPS Office 2016，繪圖采用Origin Pro 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定結(jié)果

圖1 5種植物提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibition of tyrosinase activity by five plant extracts

按照1.3.2的實(shí)驗(yàn)方法，不同濃度的植物提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率變化如圖1所示。

由圖1可知，不同植物提取物均對(duì)酪氨酸酶有抑制作用，且隨著提取物濃度逐漸增大，對(duì)酪氨酸酶的抑制率也逐漸提高，呈正相關(guān)性。其中在相同濃度范圍內(nèi)，茶葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率最高約為85%并已基本水平，其次為金盞菊提取物，銀杏葉與蒲公英提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制能力相當(dāng)且略弱于金盞菊，桔梗提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率最低。

2.2 抗氧化性能檢測(cè)

2.2.1 ABTS+清除能力的測(cè)定

圖2 5種植物提取物對(duì)ABTS+的清除作用Fig.2 The removal of ABTS+ by five plant extracts

按照 1.3.3.1的實(shí)驗(yàn)方法，不同濃度的提取物對(duì)ABTS+的清除能力如圖2所示。

由圖2可知，不同植物提取物均對(duì)ABTS+有清除作用，且對(duì) ABTS+的清除率與提取物濃度呈正相關(guān)性。在相同濃度范圍內(nèi)，茶葉提取物對(duì)ABTS+的清除率提高速度最快，其在300 μg/mL的濃度下清除率為98%并已趨于水平，其次為銀杏葉與金盞菊提取物，且兩者對(duì) ABTS+的清除能力相當(dāng)，蒲公英提取物對(duì)ABTS+的清除率弱于銀杏葉與金盞菊提取物，桔梗提取物對(duì)ABTS+的清除率最低。

2.2.2 DPPH+清除能力的測(cè)定

圖3 5種植物提取物對(duì)DPPH+的清除作用Fig.3 DPPH+ scavenging effect of five plant extracts

按照 1.3.3.2的實(shí)驗(yàn)方法，不同濃度的提取物對(duì)DPPH+的清除能力如圖3所示。

由圖3可知，在相同濃度范圍內(nèi)，不同種類(lèi)的提取物對(duì)DPPH+的清除率的變化趨勢(shì)一致，隨著提取物濃度的增大而逐漸增大，其中茶葉提取物對(duì) DPPH+的清除效果最佳，隨提取物濃度的增大而增大，其在50 μg/mL的濃度下清除率為83%并已趨于水平，銀杏葉、蒲公英和金盞菊次之，且三者提取物對(duì) DPPH+的清除能力相當(dāng)，桔梗的清除能力最差。

2.2.3 羥自由基清除能力測(cè)定

圖4 5種植物提取物對(duì)羥自由基的清除作用Fig.4 Effect of five plant extracts on hydroxyl radical scavenging

按照1.3.3.3的實(shí)驗(yàn)方法，不同濃度的提取物對(duì)羥自由基的清除率如圖4所示。

由圖4可知，不同植物提取物均對(duì)羥自由基有清除作用，且隨著提取物添加量逐漸增大，對(duì)羥自由基的清除率也逐漸提高。其中在相同濃度范圍內(nèi)，蒲公英提取物對(duì)羥自由基的清除率最高，金盞菊和銀杏葉次之，且兩者提取物對(duì)羥自由基的清除能力相當(dāng)，其次為茶葉提取物，桔梗提取物對(duì)羥自由基的清除能力最差。

2.2.4 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

圖5 5種植物提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of superoxide anion radicals by five plant extracts

按照1.3.3.4的實(shí)驗(yàn)方法，不同濃度的提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率如圖5所示。

由圖5可知，不同植物提取物均對(duì)超氧陰離子自由基有清除作用，且隨著提取物添加量逐漸增大，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率也逐漸提高。

在相同濃度范圍內(nèi)，金盞菊、蒲公英和銀杏葉提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高，且三者提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力相當(dāng)，茶葉提取物次之，桔梗提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最差。

2.3 黃酮和總酚含量的測(cè)定

按照1.3.4方法和1.3.5方法，分別測(cè)定5種植物提取物不同濃度樣品的吸光度值，再根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出5種植物中黃酮和總酚含量，結(jié)果如圖6和圖7所示。

圖6 5種植物提取物中黃酮的含量Fig.6 Flavonoid content in five plant extracts

圖7 5種植物提取物中總酚的含量Fig.7 Total phenol content in five plant extracts

由圖6可知，每種植物提取物中的黃酮含量，隨樣品濃度的變化，其值呈波動(dòng)趨勢(shì)，但幅度不大，基本趨于水平，說(shuō)明樣品濃度不影響植物中黃酮含量的測(cè)定。

進(jìn)一步比較不同植物種類(lèi)間黃酮含量，從高到低順序依次為茶葉、金盞菊、銀杏葉、蒲公英、桔梗。由圖7可知，每種植物提取物中的總酚含量，隨著提取物濃度的增大，其值基本穩(wěn)定，且不同物種間總酚含量從高到低順序依次為茶葉、金盞菊、銀杏葉、蒲公英、桔梗，與物種中黃酮含量順序基本一致。

表1 五種植物提取物抗氧化性和酪氨酸酶抑制作用匯總Table 1 Summary of antioxidant and tyrosinase inhibition of five plant extracts

3 結(jié)果

3.1 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，抗氧化即為清除相關(guān)自由基，而在酪氨酸酶促進(jìn)黑色素合成過(guò)程也需要有自由基的參與，但目前抗氧化能力與抑制酪氨酸酶活性之間的確切關(guān)聯(lián)尚不明確，相關(guān)的文獻(xiàn)研究報(bào)道也較少。本文以茶葉、金盞菊、銀杏葉、蒲公英和桔梗為研究對(duì)象，檢測(cè)其提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響、抗氧化性能、黃酮及總酚含量，探究抗氧化能力與抑制酪氨酸酶活性能力間的可能關(guān)聯(lián)。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（如圖1所示），在相同濃度范圍內(nèi)，隨著植物提取物濃度增加，其植物提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率也逐漸增大，兩者成正相關(guān)。其中茶葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率最大、已趨近于水平狀態(tài)，其次為金盞菊、銀杏葉、蒲公英，桔梗提取物對(duì)酪氨酸酶抑制率最低。采用4種常用抗氧化檢測(cè)方法，對(duì)5種植物提取物進(jìn)行抗氧化性能測(cè)定（如圖2~圖5），結(jié)果顯示采用不同抗氧化方法所測(cè)得的抗氧化強(qiáng)弱順序會(huì)有所差別，但4種抗氧化方法測(cè)定結(jié)果均表明5種植物提取物都具有一定的抗氧化性能，且提取物的濃度也與其抗氧化能力呈正相關(guān)。這一結(jié)果也提示提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率與其抗氧化作用是相關(guān)聯(lián)的，這與文獻(xiàn)報(bào)道的酪氨酸酶是多酚氧化酶，黑色素最終合成反應(yīng)是由該酶催化如超氧自由基引發(fā)的過(guò)程的情況相吻合[10]。文中進(jìn)一步測(cè)定5種植物提取物中的黃酮和總酚含量，圖7~圖8結(jié)果表明在5種植物提取物中兩者含量的高低順序基本一致，從高到低均為茶葉、金盞菊、銀杏葉、蒲公英、桔梗。通常含有黃酮和總酚類(lèi)的物質(zhì)具有抗氧化性能，故實(shí)驗(yàn)采用 4種抗氧化方法都表明5種植物提取物都具有一定的抗氧化性質(zhì)。

3.3 通過(guò)進(jìn)一步比較分析圖1、圖2、圖3、圖6和圖7的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用ABTS+、DPPH+方法測(cè)定時(shí)，5種植物提取物的抗氧化能力、對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的強(qiáng)弱順序與植物中的黃酮及總酚含量高低順序基本一致，也是茶葉的抗氧化能力和酶活抑制率最強(qiáng)，金盞菊、銀杏葉、蒲公英為其次，桔梗最弱。由此結(jié)果推測(cè)，5種植物提取物中的黃酮和酚類(lèi)物質(zhì)的含量高低可能是影響其抗氧化和酶活抑制作用大小的原因。而聯(lián)系黃酮、酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)，ABTS+、DPPH+方法相對(duì)于超氧自由基和羥基自由基方法來(lái)說(shuō)與其抗氧化性、酪氨酸酶活抑制的相關(guān)性更大，可能是由于黃酮、酚類(lèi)結(jié)構(gòu)分子對(duì)酪氨酸酶的抑制類(lèi)型有關(guān)，文獻(xiàn)表明天然植物如茶葉、蒲公英中有帶有酚羥基和羧基等基團(tuán)的功效物質(zhì)[11~15]，與酪氨酸和底物L(fēng)-多巴的結(jié)構(gòu)相似，能競(jìng)爭(zhēng)地與酪氨酸酶作用，從而抑制酪氨酸酶的活性，為競(jìng)爭(zhēng)型抑制；還有天然植物如銀杏葉，其主要成分為銀杏黃銅和銀杏內(nèi)酯，其分子結(jié)構(gòu)中的還原性羥基具有孤對(duì)電子可與酪氨酸酶分子中的Cu2+絡(luò)合從而影響該酶活性，為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制[16]。ABTS+、DPPH+兩種相關(guān)性高的方法中涉及的自由基可能與天然植物對(duì)酪氨酸酶活性抑制機(jī)理有關(guān)，具體的作用機(jī)理需要后期進(jìn)一步的深入研究。但本文結(jié)果提示，通過(guò)研究天然植物提取物的抗氧化性，可能會(huì)為研究或篩選具有抑制酪氨酸酶活性的天然美白原料提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。