鐘思恩，劉楊，曹純潔，陳美珍

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，廣東汕頭 515063）

毛頭鬼傘(Coprinus comatus)俗稱雞腿菇，其子實(shí)體含有4.11%多糖，且多糖主要由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-甘露糖和少量葡萄糖醛酸組成[1]。龍須菜(Gracilaria Lemaneiformis)和壇紫菜(Porphyra haitanensis)均屬紅藻類，都富含由D-半乳糖和3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖組成的瓊膠型多糖，分別占其藻體干重的31.05%[2]和20%～40%[3]。其中，龍須菜多糖的平均分子量較大。研究發(fā)現(xiàn)，這三種多糖均有多種生理功能，如免疫調(diào)節(jié)[4～6]、抗氧化[7～10]、抗腫瘤[11～13]、降血糖[14,15]等。

多糖具有多種生物活性，但一種多糖的功效一般側(cè)重于某一方面，有一定的局限性；將多糖按一定比例配伍后，其生理活性能起到協(xié)同增效作用[16,17]。如謝好貴等[16]將龍須菜多糖、壇紫菜多糖和毛頭鬼傘多糖以質(zhì)量配比為6：6：3組合的1000 μg/mL復(fù)合多糖作用于HeLa細(xì)胞，其增殖抑制率達(dá)76.30%，遠(yuǎn)高于3種同劑量單味多糖的最高抑制率59.63%。梁金強(qiáng)等[18]將五種真菌多糖按一定比例組成復(fù)合多糖作用于免疫抑制小鼠，發(fā)現(xiàn)復(fù)合多糖的免疫增強(qiáng)作用比各單一多糖好。多糖的生物活性也受其分子大小的影響，大分子多糖適度降解后活性增強(qiáng)。如Liao等[19]將龍須菜多糖GLP及其多糖降解組分GLP-1和GLP-2(分子量分別為121.89、57.02和14.29 ku)分別灌胃糖尿病小鼠，發(fā)現(xiàn)GLP、GLP-1、GLP-2都能降低糖尿病小鼠血糖水平，其中GLP-1降低作用最顯著；Sun等[20]將蜈蚣藻多糖GFP(220 ku)降解得到多種降解物L(fēng)GFPs，發(fā)現(xiàn)LGFP-3(8.7 ku)抗病毒活性最強(qiáng)。然而，這些報(bào)道僅限于對(duì)未降解的復(fù)合多糖和降解后的單一多糖的研究，對(duì)于降解后的海藻復(fù)合多糖尚未見國(guó)內(nèi)外有任何報(bào)道。

為了提高海藻多糖的抗腫瘤活性，本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，將毛頭鬼傘多糖、龍須菜多糖和壇紫菜多糖進(jìn)行降解，并比較降解前、后的多糖對(duì) HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響；利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選三種降解物的最佳復(fù)配比例，探究復(fù)配的三種多糖降解物體外抑制HeLa細(xì)胞增殖的協(xié)同效應(yīng)及其作用機(jī)制，以期為多糖的高效利用提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛頭鬼傘子實(shí)體購(gòu)于福建；龍須菜、末水壇紫菜：來(lái)自汕頭南澳海區(qū)，由汕頭大學(xué)海洋生物研究所南澳試驗(yàn)站陳偉洲教授鑒定。

腫瘤細(xì)胞：人宮頸癌HeLa細(xì)胞，由汕頭大學(xué)多學(xué)科研究中心提供。

正常細(xì)胞：人胚胎腎細(xì)胞 293T細(xì)胞，由汕頭大學(xué)多學(xué)科研究中心提供。

木瓜蛋白酶，sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清，杭州四季青科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，美國(guó)Amresco公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)，上海源葉生物科技有限公司；胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；三氯乙酸(TCA)、過(guò)氧化氫(H2O2)和抗壞血酸(Vc)等均為國(guó)產(chǎn)試劑分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UNICO UV2100型分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；AdVantage 2.0 BenchTop Freeze Dryer，美國(guó) VIRTIS公司；BT124S型電子分析天平，德國(guó)Sartorius公司；倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；普通光學(xué)顯微鏡，Olympus公司；離心機(jī)，Eppendorf公司；超低溫冰箱，Thremo公司；全波段掃描型酶標(biāo)儀，TECAN公司；3111型CO2培養(yǎng)箱，Thremo公司；BCM-13WA超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公司；CK30-F200型倒置顯微鏡，Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 三種多糖的提取

將原料烘干、粉碎后，按以下條件進(jìn)行提取[16]：（1）毛頭鬼傘多糖：料液比1：15，94.5 ℃浸提4 h；（2）龍須菜多糖：料液比 1：100，90 ℃浸提5 h；（3）末水壇紫菜多糖：料液比1：50，80 ℃浸提6 h。

多糖提取后過(guò)濾收集多糖液，進(jìn)行除蛋白處理。（1）毛頭鬼傘多糖除蛋白采用木瓜蛋白酶-TCA法聯(lián)用：在多糖液中加入0.5 mg/mL木瓜蛋白酶，60 ℃反應(yīng)50 min，再加入TCA使其終濃度為4.6%，22.5 ℃反應(yīng)30 min后離心，收集上清液；（2）龍須菜多糖采用TCA法除蛋白：在多糖液中加入終濃度為4% TCA溶液，過(guò)夜后，離心，收集上清液；（3）末水壇紫菜多糖采用木瓜蛋白酶-TCA法聯(lián)合除蛋白，按文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。各上清液經(jīng)流水透析2 d，蒸餾水透析1 d后，冷凍干燥得相應(yīng)的多糖樣品：毛頭鬼傘多糖CCP、龍須菜多糖GLP和末水壇紫菜多糖PHP。

1.3.2 三種多糖降解物的制備

根據(jù)前期建立的條件[19]，采用維生素 C(Vc)和H2O2降解體系，按照Vc：H2O2=1：1的質(zhì)量濃度比配制濃度為3、5、7 mmol/L降解劑分別降解三種多糖。三種多糖液濃度均為2.5 mg/mL，其中，以降解劑濃度為3 mmol/L降解CCP、5 mmol/L降解PHP、7 mmol/L降解GLP，作用2 h后，然后用超濾方法收集分子量在10～50 Ku的降解物，以分子量為8000～12000 u的透析袋蒸餾水透析1 d，分別收集相應(yīng)的多糖降解液，冷凍干燥后得多糖降解物：毛頭鬼傘多糖降解物D-CCP、壇紫菜多糖降解物D-PHP、龍須菜多糖降解物D-GLP。

1.3.3 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法[21]，以D-半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品，吸光值為縱坐標(biāo)，D-半乳糖微克數(shù)(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；得到線性回歸方程：Y=0.0071X+0.0037，Y為吸光度，X為多糖含量，相關(guān)系數(shù) R2=0.9991；求得 D-CCP、D-GLP和 D-PHP的多糖含量分別為93.63±0.98%、95.64±1.83%和97.65±2.07%。

1.3.4 多糖降解物蛋白含量測(cè)定

根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法[9,22]測(cè)得牛血清蛋白含量與吸光度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為Y=0.0046X-0.0058，R2=0.9993，X表示蛋白質(zhì)含量，Y表示吸光值。測(cè)得D-CCP、D-GLP和D-PHP蛋白質(zhì)含量分別為1.83±0.20%、1.24±0.12%和0.92±0.08%。

1.3.5 多糖降解物重均分子量測(cè)定

采用凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定各多糖降解物的重均分子量[23,24]。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Sephadex G-150層析柱中加入3 mL濃度為1 mg/mL Dextran blue 2000，采用0.1 mmol/L NaCl洗脫，每管收集1 mL。收集后，采用苯酚-濃硫酸法檢測(cè)外水體積 V0。在相同條件下，測(cè)定已知分子量的T-500、T-70、T-40、T-20、T-10標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖洗脫體積Ve，根據(jù)Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)對(duì)分子量對(duì)數(shù)值繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，Vt為內(nèi)水體積。

按上述處理，測(cè)定各多糖降解物洗脫體積Ve，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出重均分子量。

1.3.6 多糖及其降解物抑制HeLa細(xì)胞增殖作用單因素實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞配成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，于5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h。隨機(jī)分6組：CCP、GLP、PHP組和D-CCP、D-GLP、D-PHP組，其中，CCP、GLP、PHP組分別加入由完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基)稀釋的濃度梯度為200、400、600、800、1000、1200 μg/mL的各多糖液；D-CCP、D-GLP、D-PHP組分別加入由完全培養(yǎng)基稀釋的濃度梯度為20、40、60、80、100 μg/mL的各多糖降解物，作用48 h后除去上清液，加入MTT反應(yīng)4 h，棄上清，加入DMSO，室溫振搖10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀作雙波長(zhǎng)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm、參考波長(zhǎng)570 nm，測(cè)定其OD值，按式(1)計(jì)算各組別的細(xì)胞增殖抑制率。

注：A0為對(duì)陰性對(duì)照組OD值；A1為給藥組OD值。

1.3.7 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化三種多糖降解物最適配比

復(fù)合多糖降解物(簡(jiǎn)稱CDP)由D-CCP、D-GLP、D-PHP組成。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合多糖降解物的最適配比，實(shí)驗(yàn)因素水平安排如表1所示。給藥劑量均以單因素實(shí)驗(yàn)得到的最高抑制率的作用濃度80 μg/mL進(jìn)行處理。

表1 因素水平表Table 1 Factor levels table

1.3.8 CDP抑制HeLa細(xì)胞增殖的測(cè)定

取HeLa細(xì)胞和293T細(xì)胞分別配成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)18 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、陽(yáng)性組和實(shí)驗(yàn)組，其中空白組加入完全培養(yǎng)基；陽(yáng)性組加入25 μg/mL 5-FU；實(shí)驗(yàn)組分別加入 40、60、80、100、120、160、200 μg/mL CDP作用液，按分組情況對(duì)培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞和293T細(xì)胞分別進(jìn)行處理。作用48 h后移除上清液，MTT法測(cè)其OD值，計(jì)算各組的細(xì)胞增殖抑制率，方法同1.3.6。

1.3.9 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

采用細(xì)胞活性氧檢測(cè)試劑盒測(cè)定，檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光值，并于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。具體操作如下：

取密度1×105個(gè)/mL HeLa細(xì)胞懸液接種于6孔板，1 mL/孔，培養(yǎng)18 h。隨機(jī)分組：空白組、活性氧陽(yáng)性對(duì)照(Rosup)組和 40、100、160 μg/mL CDP 給藥組?？瞻捉M、Rosup組分別加完全培養(yǎng)基，CDP組分別加入各濃度CDP作用液，培養(yǎng)48 h。在裝載探針前，Rosup組加入50 μg/mL Rosup，孵育30 min，立即裝載探針。

細(xì)胞內(nèi)ROS含量測(cè)定：選擇原位裝載探針，每孔加1 mL終濃度為10 μmol/L DCFH-DA，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針，并用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，重懸于PBS中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器獲取5×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μL，用熒光酶標(biāo)儀于488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)刺激后熒光的強(qiáng)弱作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.10 NAC對(duì)CDP抑制HeLa細(xì)胞增殖的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、陽(yáng)性組、實(shí)驗(yàn)組，其中，空白組加入完全培養(yǎng)基、陽(yáng)性組加入25 μg/mL 5-FU、實(shí)驗(yàn)組分別加入 40、60、80、100、120、160、200 μg/mL CDP作用液?？瞻捉M和陽(yáng)性組均加入新鮮培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組加入10 mmol/L NAC，孵育6 h，移除上清液，PBS洗滌3次。

按分組情況進(jìn)行處理，培養(yǎng)48 h后移除上清液，MTT法測(cè)其OD值，計(jì)算各組的細(xì)胞增殖抑制率[25,26]，方法同1.3.6。

1.3.11 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分3組：空白組、CCCP陽(yáng)性對(duì)照組和CDP給藥組?？瞻捉M、CCCP陽(yáng)性對(duì)照組分別加完全培養(yǎng)基，其中CCCP組在裝載JC-1前加入10 μmol/L CCCP處理20 min，CDP組分別加入40、100、160 μg/mL CDP作用液，培養(yǎng)48 h。

吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL。參照試劑盒方法，加入JC-1染色工作液1 mL，充分混勻，于培養(yǎng)箱中孵育20 min。吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL，在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。用單因素方差分析組間差異的顯著性，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖降解物平均分子量

根據(jù)凝膠過(guò)濾層析法測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖洗脫體積，以Kav對(duì)分子量對(duì)數(shù)值繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=-4.6117X+5.7678，R2=0.9989，Y表示分子量對(duì)數(shù)值，X表示Kav。

在相同條件下，測(cè)定不同降解劑濃度下相應(yīng)多糖降解物的洗脫體積，根據(jù)回歸方程，求得各多糖降解物的重均分子量如表2所示。以下實(shí)驗(yàn)所用三種多糖降解物即為表2中的D-CCP、D-PHP、D-GLP，其重均分子量分別為18.1、15.7、18.9 ku。

表2 多糖降解物重均分子量Table 2 Molecular weight content of polysaccharides degradation products

2.2 三種多糖及其降解物抑制HeLa細(xì)胞增殖作用比較

MTT法檢測(cè)三種多糖及其降解物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果見圖1、2。

與未降解的多糖比較，一定濃度的多糖降解物對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率成倍提高，其中在濃度 80 μg/mL時(shí)，D-CCP、D-GLP、D-PHP對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率最大，分別為 56.09±3.20、42.97±1.73、47.35±3.06%，其中 D-CCP的半數(shù)抑制濃度 IC50為84.68 μg/mL；而對(duì)應(yīng)的未降解多糖要達(dá)到最大的抑制率 41.13±1.45、52.47±2.28、35.52±1.93%，則需作用劑量為1000 μg/mL的濃度，結(jié)果說(shuō)明對(duì)三種多糖適度降解可有效提高其生理活性，其中毛頭鬼傘多糖降解物效果最為顯著，其次是壇紫菜多糖降解物。

圖1 CCP、GLP、PHP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制率Fig.1 The inhibition rate of CCP, GLP, PHP on HeLa cells

圖2 D-CCP、D-GLP、D-PHP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制率Fig.2 The inhibition rate of D-CCP, D-GLP, D-PHP on HeLa cells

2.3 正交實(shí)驗(yàn)確定CDP組方配比

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化D-CCP、D-GLP和D-PHP組合配比的結(jié)果及方差分析見表3、4。

由表3可見，D-CCP、D-GLP和D-PHP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制的影響大小為D-PHP＞D-CCP＞D-GLP，CDP的最佳配方為A2B2C3，即D-CCP：D-GLP：D-PHP=4：4：5，在表4方差分析中，D-CCP和D-PHP對(duì)CDP作用有顯著性影響。對(duì)該最佳配比形成的CDP作用HeLa細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，得到的抑制率為

70.79±0.57%，顯著高于三種多糖降解物單獨(dú)作用時(shí)的最高抑制率56.09±3.20%，抑制率提高了26%，說(shuō)明三種多糖降解物復(fù)合后對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用存在協(xié)同效應(yīng)。因此，確定CDP的最適組合為

D-CCP：D-GLP：D-PHP=4：4：5。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of orthogonal experiment

表4 方差分析Table 4 Analysis is of variance

2.4 CDP對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用

由表5可見CDP對(duì)HeLa細(xì)胞作用48 h的增殖抑制率，在低濃度時(shí)，隨濃度增加而增加，但當(dāng)濃度為100 μg/mL 時(shí)，抑制率達(dá)最大值75.72%(p＜0.01)，之后隨濃度增加而顯著下降，其IC50值為67.07 μg/mL。而謝好貴[16]的研究發(fā)現(xiàn)，將未降解的龍須菜、壇紫菜和毛頭鬼傘三種多糖以最優(yōu)配比構(gòu)成的復(fù)合多糖，對(duì)HeLa細(xì)胞作用 48 h的增殖抑制率是在劑量為 1000 μg/mL時(shí)達(dá)最高值76.30%。相比之下，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將該三種多糖分別降解后再進(jìn)行配伍，可有效提高其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制活性，具有顯著的增效作用。其作用效果與小分子陽(yáng)性藥物5-FU在濃度為25 μg/mL時(shí)的抑制率接近。但5-FU對(duì)正常細(xì)胞293T有較強(qiáng)毒副作用，而CDP對(duì)293T細(xì)胞不僅無(wú)毒，還具有促生長(zhǎng)作用。表明多糖通過(guò)降解再?gòu)?fù)配可有效提高其生理活性，是一種安全有效的提高多糖功效的修飾方法，CDP具有進(jìn)一步研究開發(fā)價(jià)值。

表5 CDP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響Table 5 The effect on proliferation of HeLa cells

2.5 CDP對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

由圖3可知，CDP處理組(圖中的c、d、e)的熒光強(qiáng)度明顯高于空白組，說(shuō)明經(jīng)CDP處理后HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，其中作用劑量100 μg/mL的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，這與其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制率最高相對(duì)應(yīng)。

圖4表明，CDP可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，結(jié)合表5可知：

當(dāng)CDP濃度為40～160 μg/mL時(shí)，CDP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制能力和細(xì)胞內(nèi)ROS含量呈正相關(guān)，說(shuō)明CDP對(duì) HeLa細(xì)胞的抑制作用可能與其升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)。

圖3 DCFH-DA染色觀察CDP處理48 h后HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS水平Fig.3 ROS level in HeLa cells after CDP treading 48 h by DCFH-DA staining (400×)

2.6 NAC對(duì)CDP抑制HeLa細(xì)胞增殖的影響

圖5 NAC對(duì)CDP抑制HeLa細(xì)胞增殖活性的影響Fig.5 The effect of NAC for CDP suppressing HeLa cells proliferation

NAC是常用的細(xì)胞ROS清除劑，其作用是通過(guò)促進(jìn)GSH的產(chǎn)生來(lái)清除ROS[26]。本實(shí)驗(yàn)利用NAC的干預(yù)，以證實(shí)CDP對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用與其升高細(xì)胞內(nèi)ROS有關(guān)，結(jié)果見表6。根據(jù)表5和表6的數(shù)據(jù)，得圖5。由圖5可知，經(jīng)NAC處理后，CDP對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用明顯減弱，證實(shí)了CDP是通過(guò)提高HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS含量來(lái)抑制HeLa細(xì)胞增殖的。并且已有研究表明，5-FU對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用也與ROS生成相關(guān)[27]。

表6 NAC對(duì)CDP抑制HeLa細(xì)胞增殖的影響Table 6 The effect of NAC on CDP suppressing HeLa cells proliferation

2.7 CDP對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1是一種檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)的理想熒光探針。當(dāng)細(xì)胞線粒體膜電位比較高時(shí)，JC-1聚集于線粒體基質(zhì)中，形成產(chǎn)生紅色熒光的聚合物；當(dāng)膜電位比較低時(shí)，JC-1不能聚集于線粒體的基質(zhì)中，以單體形式存在，呈綠色熒光。

由圖6可見，空白組中HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光；CCCP陽(yáng)性對(duì)照組中，細(xì)胞線粒體膜電位幾乎完全喪失呈現(xiàn)綠色熒光；經(jīng)CDP處理后，d、e、f中細(xì)胞染色大多數(shù)呈現(xiàn)綠色熒光，紅色熒光減少，表明 CDP可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位降低。

圖6 CDP對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響(400×)Fig.6 The effect of mitochondrial membrane potential MMP

3 結(jié)論

3.1 分子量是多糖的重要指標(biāo)，研究表明，一定大小的分子量是多糖具備生物活性的必要條件，分子量大小的改變將直接影響到其理化性質(zhì)和生理活性[28]。史大華等[29]研究發(fā)現(xiàn)酸水解1 min后得到的低分子量巖藻多糖，其在濃度為1000 μg/mL時(shí)對(duì)KB細(xì)胞作用48 h后的抑制率為74.2%，顯著高于未降解的巖藻多糖在相同條件下的抑制率43.0%。Dong等[30]采用H2O2降解海參多糖 HOP(135.80 ku)，得到的降解物o-HOP(7.90 ku)，對(duì)人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞處理48 h，其IC50為7.21 μM顯著低于HOP的IC50(為14.01μM)。鄧六勤等[31]利用Vc和H2O2體系降解黃芪多糖，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖體外抗氧化和抗腫瘤作用會(huì)隨著降解片段相對(duì)分子質(zhì)量的降低而活性增強(qiáng)，其中濃度為 800μg/mL的黃芪多糖降解片段1的作用效果最好，其對(duì)HepG2細(xì)胞作用48 h后的抑制率達(dá)到57%(未降解黃芪多糖的抑制率在 40%～50%之間)。而本文利用優(yōu)化的降解條件對(duì)毛頭鬼傘、龍須菜和壇紫菜多糖分別進(jìn)行適度降解，獲得的降解產(chǎn)物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)。如對(duì)HeLa細(xì)胞，毛頭鬼傘多糖在1000μg/mL時(shí)達(dá)到最高抑制率為41.13%，而其降解產(chǎn)物僅在80 μg/mL時(shí)即可達(dá)到最高抑制率56.09%，IC50為84.68 μg/mL?？梢?，本實(shí)驗(yàn)中多糖適度降解后活性增強(qiáng)與前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。這可能是大分子多糖，其分子量達(dá)到幾十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)不等，導(dǎo)致多糖分子粘度高、溶解度低，不利于生物吸收[32,33]。而經(jīng)適度降解后，多糖分子量降低，可改善其黏度、溶解性等，還能改善生物利用度，從而提高多糖分子生物活性[34]。

3.2 多糖的協(xié)同作用并不是單一多糖簡(jiǎn)單地混合一起，而是受到包括多糖結(jié)構(gòu)、分子量、溶解度和立體構(gòu)象等諸多因素影響[35]。研究表明，復(fù)合多糖中各單一多糖的結(jié)構(gòu)與活性之間具有互效性，其藥理和營(yíng)養(yǎng)作用方面存在協(xié)調(diào)性和增效性，可以使單一多糖的作用得到發(fā)揮，并克服其作用的局限性[36]。實(shí)驗(yàn)以毛頭鬼傘、龍須菜和壇紫菜三種多糖降解物復(fù)配成復(fù)合多糖降解物，發(fā)現(xiàn)在濃度為100 μg/mL時(shí)，復(fù)合多糖降解物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率最大達(dá)到75.72%，IC50為67.67 μg/mL，均顯著高于單一多糖。證實(shí)了毛頭鬼傘、龍須菜和壇紫菜三種多糖或其降解物以一定比例復(fù)配成復(fù)合多糖[16]或復(fù)合多糖降解物，均可進(jìn)一步提高復(fù)合物對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性作用，說(shuō)明了復(fù)合多糖確實(shí)存在協(xié)同增效性。目前，復(fù)合多糖已在臨床應(yīng)用，其活性研究也取得一定進(jìn)展，但其作用機(jī)理尚不明確，仍需進(jìn)一步探討。

3.3 線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS生成的重要部位，同時(shí)也是ROS的攻擊目標(biāo)。在正常情況下，呼吸鏈在氧化磷酸化過(guò)程中不斷釋放ROS[37]，然而，當(dāng)線粒體受到損傷時(shí)，會(huì)有大量的ROS被釋放出來(lái)[38]。低濃度的ROS參與了細(xì)胞的增殖過(guò)程，可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂與細(xì)胞增殖，但隨著ROS不斷增加，氧化－還原系統(tǒng)將出現(xiàn)失衡，隨之造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和引起細(xì)胞壞死。腫瘤細(xì)胞對(duì)ROS引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)比正常細(xì)胞更為敏感，因此ROS對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷力。Maillet等[39]以含鋨有機(jī)金屬化合物作用于結(jié)腸癌鼠類模型后，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌鼠中的線粒體形態(tài)和功能發(fā)生改變，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、腫瘤生長(zhǎng)得到抑制，而這一過(guò)程是依賴ROS途徑實(shí)現(xiàn)的。此外ROS含量迅速提升，能夠?qū)е戮€粒體膜電位下降。一旦線粒體膜電位發(fā)生變化，細(xì)胞凋亡將不可逆[40]。而NAC是一種抗氧化劑，具有清除細(xì)胞內(nèi)ROS的作用，從而可以抑制細(xì)胞凋亡[41]和細(xì)胞壞死。游如旭等[42]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖刺激鼠肝癌細(xì)胞H22后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) ROS含量升高，從而引起細(xì)胞凋亡。王小軍等[43]研究發(fā)現(xiàn)紅芪多糖-1能抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且存在劑量依賴性，這一作用機(jī)制可能是紅芪多糖-1能夠調(diào)控A549細(xì)胞氧化/抗氧化能力比例。Li等[44]發(fā)現(xiàn)石榴皮多糖抗腫瘤的作用機(jī)制與線粒體途徑有關(guān)，其能引起線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase 3、9蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，CDP可以提高HeLa細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，同時(shí)可以降低細(xì)胞線粒體膜電位。而當(dāng)加入NAC與CDP共同作用時(shí)，CDP對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用顯著降低。表明CDP可以通過(guò)提高ROS含量直接抑制HeLa細(xì)胞增殖；而CDP是否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致過(guò)多的ROS攻擊線粒體，引起線粒體膜電位下降，從而通過(guò)線粒體途徑啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡程序，造成細(xì)胞凋亡，這一機(jī)制尚待研究。