翟紅月，敬思群，柴文杰，趙正梅

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046）

（2.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005）

雪菊（Coreopsis tinctoria），學(xué)名雙色金雞菊，通常又稱“清三高花”[1]。新疆昆侖雪菊生長(zhǎng)在海拔3000米以上的昆侖山北麓一帶，含有多種對(duì)人體有益的活性成分。新疆維吾爾族民間以雪菊制作茶飲，長(zhǎng)期飲用可治療腹瀉、高血脂、腸胃不適、燥熱、高血壓等疾病[2,3]。肝臟為人體內(nèi)最復(fù)雜的代謝器官，也被視為身體的重要屏障器官。肝臟疾病在我國(guó)發(fā)病范圍較廣、發(fā)病率較高，給人們的健康造成嚴(yán)重危害，產(chǎn)生極大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。肝細(xì)胞損傷是各型肝病的病理基礎(chǔ)，治療與糾正肝細(xì)胞損傷是各型肝病治療的主要措施之一[5,6]。此外，線粒體功能障礙可引起各種肝衰竭、肝損傷、脂肪肝等肝臟病變[7,8]。近年來，中西醫(yī)結(jié)合治療肝臟疾病的經(jīng)驗(yàn)日益豐富，尤其是植物活性成分運(yùn)用較為廣泛[9,10]，例如葡萄籽原花青素可能通過促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞增殖、抑制肝組織細(xì)胞凋亡和自噬，對(duì)小鼠肝損傷起到保護(hù)作用[11]；蓮房原花青素對(duì)大鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)[12]，昆侖雪菊原花青素的保肝作用鮮有深入研究。

昆侖雪菊原花青素（Kunlun Chrysanthemum Proanthocyanidins, KCPC）是雪菊的次生代謝產(chǎn)物（超聲輔助法提取率為13.29%[13]）。原花青素是由不同數(shù)量的黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成的聚合物的總稱[14]，有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和抗氧化性[15,16]，能較好的清除氧游離基[17]、抑制腫瘤[18]，提高免疫力和防御紫外線輻射[19]，是一種良好的天然抗氧化劑[20,21]。前期實(shí)驗(yàn)對(duì)昆侖雪菊的三種活性成分（原花青素、多糖及總黃酮，實(shí)驗(yàn)室自制）進(jìn)行了保肝作用研究，通過檢測(cè)小鼠血清中AST、ALT水平，發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊多糖及總黃酮不能顯著降低小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活性，無明顯的肝保護(hù)作用，而昆侖雪菊原花青素(高劑量組)有顯著性保護(hù)作用[22]，因此本研究以此為基礎(chǔ)，擬采用CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷為模型，進(jìn)一步深入探討昆侖雪菊原花青素對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為研發(fā)治療肝臟疾病的新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊由新疆和田沙漠玫瑰有限責(zé)任公司提供，經(jīng)新疆大學(xué)阿不都拉·阿巴斯教授鑒定為兩色金雞菊Coreopsis basalis的干燥花蕾；昆侖雪菊原花青素，實(shí)驗(yàn)室自制（昆侖雪菊原花青素含量為26.58 mg/g，經(jīng) AB-8大孔樹脂純化后純度為(63.76±0.34)%；HPLC-MS分離檢測(cè)出14個(gè)組分，后通過HPLC分析得表兒茶素和原花青素 B2含量分別為 12.19%、0.91%，尚未發(fā)表）；ALT、AST試劑盒、GSH-Px、SOD、MDA、SDH試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；CCl4購自天峰試劑有限公司；橄欖油，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1100D型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；邁瑞 BS-120全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；FZ102-SIM真空冷凍干燥設(shè)備，德國(guó)西門子公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Anke TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種雄性小白鼠，購買于新疆醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：NO.650007000，使用許可證編號(hào)：SYXK（新）2011-0001）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 CC14誘導(dǎo)肝損傷小鼠分組及處理方式

昆明種雄性小白鼠60只，4周齡，按體重隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、陽性藥物組（聯(lián)苯雙酯，300 mg/kg）、KCPC低（200 mg/kg）、中（400 mg/kg）、高劑量（800 mg/kg）給藥組（劑量設(shè)置根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)參考文獻(xiàn)[22,23]）。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后稱重。每天一次受試組分別灌胃相應(yīng)劑量，正常組、模型組給予蒸餾水，連續(xù)給藥15 d。15 d灌胃給藥后2 h，模型組及各給藥組均腹腔注射0.1% CCl（4用橄欖油稀釋）10 mL/kg，而正常組注射不含CCl4的橄欖油10 mL/kg，禁食，18 h后取血，3000 r/min離心10 min制備血清。處死小鼠后取肝臟、胸腺、脾臟器官，稱其重量，分別計(jì)算肝臟、胸腺和脾臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

胸腺指數(shù)=胸腺濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

脾臟指數(shù)=脾臟濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.4.2 肝損傷生化指標(biāo)的檢測(cè)

血清中的 ALT，AST水平和肝組織中 SOD，GSH-Px活性和MDA 的含量均按試劑盒說明書操作。

1.4.3 KCPC對(duì)線粒體腫脹的影響及SDH含量的影響

小鼠肝線粒體的提取參考王建華的方法[24]。取小鼠肝臟組織冰浴下以0.32 M蔗糖制成10%勻漿，將其在1500 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清液，沉淀顆粒重懸浮于 10 mL的 1 mM的 EDTA和 10 mM Tris-HCl（pH 7.1）分離緩沖液中在相同條件下進(jìn)行離心。合并兩次上清液，再以17000 r/min離心20 min。沉淀再次加入分離緩沖液洗滌離心后（7000 r/min，15 min），即為線粒體沉淀物。

將上述制備的線粒體加入 3.0 mL生理鹽水制成肝線粒體懸浮液，取0.4 mL KCPC溶液（0.5 mg/mL），于肝線粒體懸浮液中，再加入0.5 nmol/L的硫酸亞鐵溶液0.4 mL和0.5 nmol/L的Vit.C溶液0.4 mL，迅速混勻激發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)體系放入 37 ℃水浴鍋中保溫?？瞻捉M用生理鹽水替代硫酸亞鐵和 Vit.C溶液，對(duì)照組生理鹽水替代樣品溶液。在520 nm處測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間后的吸光值，線粒體膜受氧化損傷而發(fā)生腫脹，吸光值下降。按照試劑盒說明檢測(cè)SDH含量，在600 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算SDH活力。

1.4.4 肝組織病理組織學(xué)觀察

選取小塊肝右葉未有機(jī)械損傷處的組織，固定在預(yù)先配好的10%甲醛中，石蠟包埋切片，觀察肝組織病理變化。

1.4.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 KCPC對(duì)CCl4致小鼠肝損傷肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)的影響

由表1可知，與正常組相比，模型組小鼠肝臟重量上升，肝臟指數(shù)極顯著增加（p<0.01），說明肝臟可能出現(xiàn)損傷，導(dǎo)致在一定程度上病變腫大；與模型組相比，KCPC高劑量組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低（p<0.05），為模型組的 90.55%。胸腺為體內(nèi)重要免疫器官是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化的主要場(chǎng)所。脾臟為機(jī)體的淋巴器官，含淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。因此，胸腺和脾臟指數(shù)可作為免疫反應(yīng)功能變化的參考指標(biāo)[25]。由結(jié)果可知，模型組小鼠的脾臟指數(shù)相比正常組顯著升高（p<0.05），說明CCl4激發(fā)了小鼠機(jī)體的免疫反應(yīng)，且KCPC各劑量組的胸腺和脾臟指數(shù)相比模型組均有所降低，但無顯著性差異（p>0.05）。

2.2 小鼠血清中各項(xiàng)生化指標(biāo)的變化

ALT、AST主要分布在肝臟中，當(dāng)小鼠機(jī)體受到CCl4誘導(dǎo)時(shí)，大量自由基產(chǎn)生，如三氯甲烷自由基(CCI3·)[26]等，引起膜的脂質(zhì)過氧化，從而改變肝細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ALT和AST大量外泄進(jìn)入血清，在一定程度上可以反應(yīng)肝細(xì)胞的受損程度[27]。各組小鼠血清中ALT、AST活性檢測(cè)結(jié)果見圖1。

表1 KCPC對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Table 1 Influence of liver coefficient of CCl4-induced liver injury in mice of KCPC (±s，n=10)

表1 KCPC對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Table 1 Influence of liver coefficient of CCl4-induced liver injury in mice of KCPC (±s，n=10)

注：與正常對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05。

組別 肝臟指數(shù)/×10-3脾臟指數(shù)/×10-3胸腺指數(shù)/×10-3正常組 50.09±5.29 3.79±0.62 1.53±0.12模型組 58.31±3.36** 4.71±0.76* 1.77±0.35陽性組 56.10±3.61* 3.97±0.34 1.69±0.37 KCPC 低劑量組 56.65±3.62* 4.34±0.67 1.71±0.29 KCPC 中劑量組 53.86±4.83 4.20±0.66 1.63±0.18 KCPC 高劑量組 52.80±3.96# 4.17±0.63 1.65±0.34

圖1 KCPC對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST的影響Fig.1 Influence of serum transaminases ALT and AST of CCl4-induced liver injury in mice of KCPC (±s，n=10)

與正常組相比，模型組血清中ALT、AST顯著上升（p<0.01），表明肝細(xì)胞受到一定程度的損傷，造模成功；與模型組相比，KCPC中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST活性極顯著降低（p<0.01），其中KCPC高劑量組（800 mg/kg）ALT、AST活性分別比模型組降低了 82.46%和 69.41%，強(qiáng)于陽性藥物聯(lián)苯雙酯（29.15%、8.80%）。

2.3 小鼠肝臟中各項(xiàng)生化指標(biāo)的變化

圖2 KCPC對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝組織SOD（圖a）、GSH-Px活性（圖b）和MDA含量（圖c）的影響Fig.2 Influence of SOD (a), GSH-Px activity (b), and MDA level(c) of CCl4-induced liver injury in mice liver tissue of KCPC(±s，n=10)

MDA是脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，為評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)[28]；SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化物酶，能夠評(píng)價(jià)機(jī)體清除氧自由基的能力。各組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量結(jié)果見圖 2。與模型組相比，KCPC中、高劑量組肝組織SOD、GSH-Px活性顯著增加，MDA含量顯著下降（p<0.01），其中KCPC高劑量組小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性分別比模型組增加了 101.08%和92.13%，MDA含量降低了45.16%。各指標(biāo)呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，隨著劑量的增大，抗氧化酶活性相應(yīng)增加，由結(jié)果可知，KCPC各劑量組能夠提高機(jī)體抗氧化酶的活性，加速體內(nèi)清除自由基的能力，降低脂質(zhì)過氧化發(fā)生，對(duì)肝損傷起到保護(hù)作用，這與鄒金發(fā)[29]等人研究原花青素對(duì)大鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用一致，肝組織SOD活性顯著升高(p<0.01)，MDA含量顯著下降（p<0.01），表明原花青素在大鼠體內(nèi)很好的發(fā)揮了抗氧化作用，清除了自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。

2.4 KCPC對(duì)線粒體腫脹的影響及SDH活性影響

圖3 KCPC對(duì)線粒體腫脹度的影響Fig.3 Effect of KCPC on mitochondrial swelling

圖4 KCPC對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝臟線粒體SDH活力的影響Fig.4 Influence of SDH activity CCl4-induced liver injury in mice liver tissue of KCPC (±s，n=10)

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場(chǎng)所，是多類藥物的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)和功能正常對(duì)維持生物體的正?；顒?dòng)有重要的意義。采用Fe2+-Vc體系可引起線粒體的膜構(gòu)造改變，使其喪失屏障功能，內(nèi)外離子交換發(fā)生障礙。線粒體腫脹發(fā)生后，線料體懸液的渾濁度下降，使得其在520 nm處吸光值下降[30]。由圖3可以看出，正常組曲線趨于平緩，KCPC組相比對(duì)照組變化幅度較小。當(dāng)Fe2+-Vc作用10~40 min時(shí)，對(duì)照組的線粒體腫脹逐漸加重，懸液渾濁度下降，吸光值明顯降低，反應(yīng)60 min時(shí)，KCPC組與正常組沒有顯著差異（OD值分別為0.747±0.034和0.702±0.024），說明 KCPC具有抑制線粒體腫脹的能力，可能是KCPC減輕了自由基導(dǎo)致的線粒體氧化損傷，恢復(fù)了ATP酶活性[31]。

SDH是一種線粒體內(nèi)膜結(jié)合的酶，參與氧化磷酸化和電子轉(zhuǎn)移的過程，為線粒體的有氧呼吸鏈提供電子，是線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，因此SDH為線粒體的標(biāo)志性酶，其活性反應(yīng)線粒體功能的強(qiáng)弱[32]。

由圖4可知，與正常組相比，模型組肝臟線粒體SDH活性顯著降低（p<0.01）；與模型組相比，KCPC中、高劑量組分別使SDH活性增加22.15%和53.76%（p<0.05或p<0.01）。隨著KCPC劑量的增加，對(duì)肝臟線粒體的保護(hù)作用越大。

2.5 肝組織病理觀察結(jié)果

圖5 不同組小鼠肝細(xì)胞HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Morphology of liver cells from different groups

將固定好的肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，結(jié)果如圖 5所示。正常組肝細(xì)胞索排列整齊，有完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大小正常，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖 5a，5b）。模型組肝組織有多處壞死，肝細(xì)胞疏松、腫脹，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見明顯的點(diǎn)狀和灶狀壞死，變性肝細(xì)胞彌漫性腫大，胞漿空泡明顯，廣泛脂肪變性，其中以肝小葉中央?yún)^(qū)最為嚴(yán)重，壞死處肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，中央靜脈及肝血竇充血水腫（見圖 5c，5d）。KCPC低劑量組和陽性對(duì)照組肝臟組織損傷有所減少，表現(xiàn)為點(diǎn)狀和灶狀壞死的肝細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞減少（見圖5e，5f；5g，5h）；KCPC中、高劑量組絕大部分肝組織結(jié)構(gòu)正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝竇恢復(fù)正常，肝索呈放射狀排列，說明其對(duì)小鼠肝細(xì)胞的保護(hù)效果較為明顯（見圖 5i，5j；5k，5l）。

3 結(jié)論

本研究通過建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型，發(fā)現(xiàn) KCPC對(duì)肝損傷具有一定的保護(hù)作用，且隨著KCPC劑量的增加，對(duì)肝組織的保護(hù)作用越明顯，KCPC高劑量組強(qiáng)于陽性對(duì)照聯(lián)苯雙酯。KCPC能夠顯著降低血清中 ALT、AST的含量（p<0.01），使肝臟中MDA含量顯著下降（p<0.01)，抗氧化酶GSH-Px和SOD活力顯著升高（p<0.01)，此外，KCPC能夠抑制線粒體腫脹，顯著增加 SDH的活性（p<0.01)，減輕肝細(xì)胞線粒體的損傷。因此，推測(cè)KCPC可能通過提高抗氧化物酶的活性，從而減少氧化應(yīng)激發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。