林嘉明，牛隴星，黃 倩，蔣雪峰，李明忠,2

(1. 蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，蘇州 215021; 2.南通紡織絲綢產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，南通 226000)

異型雙功能化合物是用于對蛋白質(zhì)、酶、抗體、疫苗等生物大分子進(jìn)行修飾或交聯(lián)的高效、低毒性試劑[1-2]。大多數(shù)異型雙功能試劑能在生物大分子間起架橋作用，使多個分子相互鍵合交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并調(diào)節(jié)大分子鏈間的次價鍵[3-4]。N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)[5-6]的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

SPDP既是一種活潑酯，能與蛋白質(zhì)側(cè)鏈的氨基反應(yīng)；又能充當(dāng)巰基試劑，與巰基化合物發(fā)生置換反應(yīng)生成二硫鍵[7]。利用該性質(zhì)，可將兩個蛋白質(zhì)大分子連接到一起[8-9]。

柞蠶絲素蛋白(ASF)具有良好的生物相容性，對細(xì)胞的粘附能力強，可被降解，用作生物醫(yī)學(xué)材料具有廣闊的開發(fā)前景[10-11]。用柞蠶絲素蛋白制備生物醫(yī)用材料的過程中，往往需對其進(jìn)行交聯(lián)。常用于對蛋白質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)的戊二醛[12-13]、縮水甘油醚等試劑雖然有效，但往往具有一定程度的細(xì)胞毒性[14]。尋找新的交聯(lián)方式，是制備生物醫(yī)用柞蠶絲素蛋白材料過程中需要研究的問題。

本文使SPDP在溶液中與柞蠶絲素蛋白反應(yīng)，用紅外吸收光譜、X-射線光電子能譜和圓二色光譜對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，探討用SPDP改性后對柞蠶絲素蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

柞蠶生絲(遼寧省丹東市)，SPDP(瑞典Pharmacia公司)，二巰蘇糖醇(DTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)，四水硝酸鈣、氯化鈣、碳酸氫鈉等均為分析純。

1.2 實驗儀器

傅立葉變換紅外光譜儀(Nicolet 5700，美國Nicolet公司)、圓二色光譜儀(Mode1410，美國，AVIV)、X-射線光電子譜儀(Axis Ultra HAS，日本KRATOS公司)、冷凍干燥機(Genesis25-LE，美國VIRTIS公司)。

1.3 柞蠶絲素蛋白溶液的制備

取100 g柞蠶生絲，置于5 L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5‰的碳酸鈉溶液，98 ℃～100 ℃處理3次，每次處理時間分別為30、30、45 min。去離子水洗凈后，在60 ℃的烘箱中干燥后得到柞蠶絲素纖維。

將四水硝酸鈣熔融過濾，于105 ℃下溶解柞蠶絲素纖維，浴比1∶10，5 h后待柞蠶絲素纖維全部溶解，得到柞蠶絲素混合溶液。冷卻后的柞蠶絲素混合溶液裝入透析袋(截留分子量9～12 kDa)，在去離子水中透析，每2 h更換一次水，持續(xù)3 d。經(jīng)過濾后得到柞蠶絲素蛋白溶液，重量法測定絲素溶液濃度。

1.4 SPDP對柞蠶絲素蛋白的改性

將16mg的SPDP溶解于8 mL的二甲基亞砜溶液中，磁力攪拌器攪拌30～40 min后，在4℃冰箱中靜置1h，配置成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。如表1所示，分別向20 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的柞蠶絲素蛋白溶液滴加0.25、0.5、1.0、2.0 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的SPDP溶液，緩慢攪拌，冰浴下反應(yīng)6 h，4 ℃過夜進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。反應(yīng)后離心取上層清液，去離子水中透析3 d。取15 mL透析好的溶液裝入離心管中，加入0.5 mM的二巰蘇糖醇。緩慢攪拌，冰浴下反應(yīng)30 min，4 ℃過夜進(jìn)行還原反應(yīng)。反應(yīng)后離心取上層清液，去離子水中透析3 d。

最后，將還原反應(yīng)后的溶液與酰胺化反應(yīng)的溶液混合，緩慢攪拌，pH值7.38，冰浴下反應(yīng) 6 h，4 ℃過夜進(jìn)行巰基-二硫鍵交換反應(yīng)。反應(yīng)后離心取上清液，然后去離子水中透析3 d，再經(jīng)過冷凍干燥后得到用占柞蠶絲素質(zhì)量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0% 的SPDP改性后的柞蠶絲素蛋白。

表1 SPDP改性柞蠶絲素(ASF)反應(yīng)所用各組分的量

1.5 紅外吸收光譜

將未經(jīng)改性及改性后的柞蠶絲素固體剪成微細(xì)顆粒，用150目篩網(wǎng)濾得到的顆粒經(jīng)KBr壓片制樣，用Nicolet 5700 FT-IR 型傅立葉變換紅外光譜儀測定400～4 000cm-1之間的紅外吸收光譜。

1.6 X-射線光電子能譜

分別取相同體積的未經(jīng)改性及經(jīng)改性后的柞蠶絲素蛋白溶液室溫干燥制成絲素膜，裁剪成 2 020 mm2大小，粘附在樣品托上，用X-射線光電子能譜儀分析絲素膜表面的化學(xué)組成。

1.7 圓二色光譜

未經(jīng)改性及經(jīng)改性后的柞蠶絲素蛋白溶液經(jīng)去離子水稀釋后，用Model410型圓二色光譜儀測定其分子構(gòu)象，實驗溫度為25 ℃，波長范圍為190～250 nm，掃描速度為50 nm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPDP與柞蠶絲素蛋白的反應(yīng)原理

如圖1所示，柞蠶絲素蛋白與SPDP反應(yīng)過程經(jīng)過酰胺化反應(yīng)、DTT巰基還原反應(yīng)、巰基—二硫鍵交換反應(yīng)三個步驟。步驟(1)是先在柞蠶絲素蛋白大分子的游離氨基上引入吡啶二硫基；步驟(2)是衍生的吡啶二硫基在DTT的還原下產(chǎn)生巰基；步驟(3)通過巰基交換反應(yīng)與另一個ASF大分子交聯(lián)，產(chǎn)生異二聚物絲素蛋白質(zhì)。

(1)(2)(3)

圖1柞蠶絲素蛋白(ASF)與SPDP反應(yīng)原理示意圖

2.2 經(jīng)SPDP改性后柞蠶絲素蛋白的紅外吸收光譜

研究表明，在柞蠶絲素蛋白的紅外吸收光譜中，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的特征吸收出現(xiàn)在660 cm-1(酰胺Ⅴ)附近；α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收為1 655 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 546 cm-1(酰胺Ⅱ)、1 270 cm-1(酰胺Ⅲ)、625 cm-1(酰胺Ⅴ)附近；β-折疊結(jié)構(gòu)的特征吸收則出現(xiàn)在1 630 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 520 cm-1(酰胺Ⅱ)、1 240 cm-1(酰胺Ⅲ)、695 cm-1(酰胺Ⅴ)附近[15-16]。由圖2(a)的可見，未經(jīng)改性的柞蠶絲素的紅外吸收光譜在1 658 cm-1、1540 cm-1、1 246 cm-1、894 cm-1、665 cm-1處有明顯的吸收帶，說明未經(jīng)改性的柞蠶絲素的分子構(gòu)象主要是α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。由圖2(b、c、d)可見，經(jīng)SPDP改性后，柞蠶絲素蛋白在1 658 cm-1、1 540 cm-1、665 cm-1處的峰分別向1 632 cm-1、1 523 cm-1、700 cm-1偏移，這些是β-折疊結(jié)構(gòu)的特征吸收峰。表明柞蠶絲素蛋白與異型雙功能試劑SPDP反應(yīng)后，其分子構(gòu)象發(fā)生了α-螺旋和無規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。另外，柞蠶絲素經(jīng)SPDP改性后，在620 cm-1附近產(chǎn)生了新的吸收峰，這是二硫鍵(-S-S-)的特征吸收峰[17]，表明SPDP與柞蠶絲素蛋白發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，以二硫鍵的形式連接柞蠶絲素蛋白。

(a)改性前；(b，c，d，e)分別經(jīng)0.5%、1.0%、2.0%、4.0% SPDP改性后圖2 SPDP改性前后柞蠶絲素蛋白的紅外吸收光譜

2.3 經(jīng)SPDP改性后柞蠶絲素蛋白的元素組成

表2 經(jīng)SPDP改性后柞蠶絲素蛋白中各元素含量

用X-射線光電子能譜測得的經(jīng)SPDP改性后柞蠶絲素蛋白中各元素含量見表2。未經(jīng)改性的柞蠶絲素蛋白中C、N、O元素的含量分別為67.7%、19.6%和12.7%，而S元素含量為0。檢測不到S元素是由于柞蠶絲素蛋白中含硫氨基酸極少，半胱氨酸及甲硫氨酸的含量分別僅為0.04%和0.03%左右，基本可以忽略。經(jīng)SPDP改性后，柞蠶絲素蛋白的元素組成發(fā)生了顯著變化，隨著SPDP用量的增多，改性后絲素蛋白內(nèi)N元素的含量減少，而O和S元素含量則相應(yīng)增多。當(dāng)用占絲素蛋白4.0%的SPDP改性后，柞蠶絲素蛋白的N元素含量從19.6%減少到15.0% ；O和S元素則分別從12.7%和0增多到15.9%和2.4% 。表明SPDP有效地與柞蠶絲素蛋白發(fā)生反應(yīng)，改變了原柞蠶絲素蛋白的元素組成，尤其是使S元素的含量顯著增多。

2.3 經(jīng)SPDP改性后柞蠶絲素蛋白的圓二色光譜

蛋白質(zhì)的光學(xué)活性基團主要是肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵等等，對平面圓偏振光的吸收不同，產(chǎn)生吸收差異，這就是蛋白質(zhì)的圓二色性[18]。遠(yuǎn)紫外區(qū)(178～250 nm)的圓二色光譜主要是反映肽鍵的圓二色性。單一波長常常用于測定蛋白質(zhì)或多肽由于動力學(xué)或熱力學(xué)引起的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲)的變化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同所產(chǎn)生的圓二色譜帶的位置和強弱都不同。α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰是在222 nm和208 nm處會出現(xiàn)負(fù)峰，在192 nm處出現(xiàn)一個正峰；β-折疊的特征峰是在216 nm出現(xiàn)一個負(fù)峰，在195 nm處出現(xiàn)一個正峰；而無規(guī)卷曲的特征峰是在200 nm處出現(xiàn)一個負(fù)峰，在 212 nm出現(xiàn)一個正峰[18]。

(a)改性前；(b)改性后圖3 SPDP改性前后柞蠶絲素蛋白的圓二色光譜

由圖3(a)可見，改性前的柞蠶絲素在191 nm處出現(xiàn)正峰，在206 nm和220 nm處出現(xiàn)負(fù)峰，屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰。說明改性前柞蠶絲素的分子構(gòu)象主要是α-螺旋結(jié)構(gòu)。由圖3(b)可見，當(dāng)SPDP與柞蠶絲素蛋白反應(yīng)后，改性后的柞蠶絲素蛋白在195 nm處出現(xiàn)正峰，在216 nm附近出現(xiàn)弱的負(fù)峰，屬于β-折疊結(jié)構(gòu)的特征峰；在206 nm處出現(xiàn)負(fù)峰，屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰；說明柞蠶絲素經(jīng)SPDP改性后，部分α-螺旋或無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。表明當(dāng)柞蠶絲素蛋白與SPDP發(fā)生反應(yīng)后其分子構(gòu)象發(fā)生了從α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。

3 結(jié)論

異型雙功能試劑SPDP與柞蠶絲素蛋白經(jīng)酰胺化反應(yīng)、巰基還原反應(yīng)、巰基—二硫鍵交換反應(yīng)后，初步研究結(jié)果表明，能夠使柞蠶絲素蛋白N元素含量減少，O和S元素含量相應(yīng)增多，柞蠶絲素蛋白的部分α-螺旋或無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。反應(yīng)效率高、毒性低的雙功能試劑SPDP有可能作為一種新的改性或交聯(lián)試劑，用于柞蠶絲素生物材料的制備。