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        HPLC-DAD同時(shí)測(cè)定養(yǎng)肝解毒丸中5種活性成分的含量△

        2018-11-06 05:58:28孫強(qiáng)劉斌杜海云
        中國(guó)現(xiàn)代中藥 2018年10期
        關(guān)鍵詞:解毒丸養(yǎng)肝丹皮

        孫強(qiáng),劉斌,杜海云

        (泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東 泰安 271000)

        養(yǎng)肝解毒丸是由龍膽草、夏枯草、熟地黃、五味子、山茱萸、牡丹皮等十二味中藥組成的復(fù)方制劑,有滋腎、解毒之功效,用于慢性肝炎,轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)不降者。龍膽草其有效成分龍膽苦苷對(duì)肝臟化學(xué)損傷和免疫損傷有保護(hù)作用[1-2];夏枯草具有清肝瀉火、明目的作用,迷迭香酸作為其指標(biāo)性成分[3-4];五味子具有滋補(bǔ)、強(qiáng)身、安神的作用,五味子醇甲為其指標(biāo)性成分[5];山茱萸具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗菌、抗炎等作用[6-7],馬錢苷為其指標(biāo)性成分;牡丹皮主要活性成分丹皮酚具有保護(hù)肝腎、抗炎、解熱等多種藥理作用[8-9]。本研究以龍膽草中的龍膽苦苷、夏枯草中的迷迭香酸、五味子中的五味子醇甲、山茱萸中的馬錢苷、牡丹皮中的丹皮酚為定量指標(biāo),同時(shí)對(duì)養(yǎng)肝解毒丸中的多種成分的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)5種成分紫外吸收特征的不同,采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢查法,在3個(gè)紫外波長(zhǎng)下,同時(shí)測(cè)定5種活性成分的含量。結(jié)果表明,本法結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,分離效果好,可為養(yǎng)肝解毒丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司),SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器(日本島津公司),LC solution工作站;十萬(wàn)分之一電子天平(Mettler Toledo XS205DU)

        1.2 試藥

        龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào):110770-201314)、五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):110857-201412)、馬錢苷對(duì)照品(批號(hào):111640-201005)、丹皮酚對(duì)照品(批號(hào):110708-201005)、迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào):111871-201505),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;養(yǎng)肝解毒丸(魯藥制字Z09080126,批號(hào):171026、171109、180101);甲醇為色譜純,磷酸等均為分析純,水為純化水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:Waters Hss C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-0.5%磷酸水溶液(B),采用梯度洗脫(0~10 min,30%A;10~20 min,30%~40%A;20~30 min,40% ~80%A;30~40 min,80%~30%A);檢測(cè)波長(zhǎng):馬錢苷、五味子醇甲240 nm,龍膽苦苷、丹皮酚275 nm,迷迭香酸330 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10μL。龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均不低于6000。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲對(duì)照品適量,分別加80%甲醇制成質(zhì)量濃度為560、456、203、682、218μg·mL-1的對(duì)照品貯備液。再分別精密量取貯備液適量,加80%甲醇制成含龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲分別為56.0、45.6、20.3、68.2、21.8μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液 取本品,研細(xì),精密稱定1.0 g,置具塞錐形瓶中,精密加入乙醚30 mL,超聲處理(功率300 W,頻率50 KHz)15 min,放冷,過(guò)濾,取濾渣晾干后備用。將濾渣至于錐形瓶中精密加入80%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率50 KHz)30 min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò),即得供試品溶液。

        2.2.3 陰性對(duì)照樣品溶液 按制劑制備方法,分別制備不含龍膽草、山茱萸、夏枯草、牡丹皮、五味子的陰性樣品,按2.2.2項(xiàng)下的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

        2.3 空白試驗(yàn)

        按上述色譜條件,分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照樣品溶液各10μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果表明:陰性對(duì)照樣品溶液在與龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲對(duì)照溶液相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn),處方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。HPLC圖見(jiàn)圖1~7。

        圖1 養(yǎng)肝解毒丸對(duì)照品HPLC圖

        圖2 養(yǎng)肝解毒丸樣品HPLC圖

        圖3 缺龍膽草陰性對(duì)照樣品HPLC圖

        圖4 缺山茱萸陰性對(duì)照樣品HPLC圖

        圖5 缺夏枯草陰性對(duì)照樣品HPLC圖

        圖6 缺牡丹皮陰性對(duì)照樣品HPLC圖

        圖7 缺五味子陰性對(duì)照樣品HPLC圖

        2.4 線性關(guān)系考察

        分別精密吸取龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲儲(chǔ)備液各0.1、0.5、1、2.5、5 mL分別置10 mL量瓶中,加80%甲醇稀釋至刻度,制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液,依法測(cè)定,記錄色譜圖,量取峰面積。以峰面積 Y對(duì)濃度X(μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸,龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲的回歸方程分別為:Y=1.034×104X+1.120×103(r=0.999 6)、Y=3.005×104X-1.703×103(r=0.999 8)、Y=3.604×104X+2.322×103(r=0.999 3)、Y=7.876×104X+1.024×103(r=0.999 5)、Y=5.107×104X-1.084×103(r=0.999 7),龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的線性范圍分別為 5.60~280、4.56~228、2.03~101.5、6.82~341、2.18~109μg·mL-1。

        2.5 精密度試驗(yàn)

        取混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,以峰面積考察精密度,龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲面積的RSD分別為0.3%、0.6%、0.5%、0.4%、0.6%。

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

        按2.2.2項(xiàng)下,平行制備同一樣品(批號(hào):180101)6份,依上述色譜條件依法進(jìn)行測(cè)定,并分別計(jì)算含量,龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲的含量平均值分別為1.08、0.87、0.37、1.24、0.38 mg·g-1,RSD分別為 0.7%、0.9%、0.6%、0.5%、0.8%。

        2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取供試品,按照2.2.2項(xiàng)下方法處理,依上述色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12 h依次進(jìn)行測(cè)定,龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲面積的RSD分別為0.4%、0.5%、0.6%、0.3%、0.6%。

        2.8 回收率試驗(yàn)

        精密稱取已知含量的樣品1.0 g,共6份,分別精密加入龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲對(duì)照品貯備液2.0 mL,照2.2.2項(xiàng)下方法制成加樣回收供試液,依上述色譜條件依法進(jìn)行測(cè)定,并分別計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

        2.9 樣品測(cè)定

        取本品3批樣品,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,用外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中龍膽苦苷、馬錢苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

        3 討論

        3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

        養(yǎng)肝解毒丸由十二味中藥組成,為了能同時(shí)檢測(cè)5種活性成分,采用二極管陣列檢測(cè)器,多波長(zhǎng)檢測(cè)各成分的含量。龍膽苦苷在275 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,靈敏度高,無(wú)干擾峰,丹皮酚在202、275、314 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,因此選擇275 nm作為它們共同的測(cè)定波長(zhǎng);馬錢苷在240 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,五味子醇甲在240~250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有很大吸收,在此波長(zhǎng)下馬錢苷、五味子醇甲吸收值高,分離度好,因此選擇240 nm為兩者的測(cè)定波長(zhǎng);迷迭香酸在203、280、330 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,從圖2看出在330 nm處?kù)`敏度高,無(wú)干擾峰,故選擇此波長(zhǎng)檢測(cè)。

        3.2 流動(dòng)相的選擇

        參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-12],試驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-0.5%磷酸溶液和甲醇-2%醋酸溶液3種流動(dòng)相分別進(jìn)行試驗(yàn)考察,結(jié)果以甲醇-0.5%磷酸為流動(dòng)相,峰型更尖銳,分離度更好,理論塔板數(shù)更高。同時(shí)為了使所測(cè)物質(zhì)的色譜峰分離度更好,出峰時(shí)間更合理,采用梯度洗脫的方法。通過(guò)對(duì)甲醇和0.5%磷酸溶液的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)和優(yōu)化,使得所測(cè)5種活性成分均峰形良好,保留時(shí)間適宜,不受雜質(zhì)峰的影響,見(jiàn)圖2。

        3.3 供試品溶液制備方法的考察

        首先先用甲醇對(duì)藥材進(jìn)行了提取,發(fā)現(xiàn)色譜峰雜質(zhì)比較多,故用乙醚對(duì)極性小的成分進(jìn)行提取,

        分離。提取后的藥渣再以甲醇、80%甲醇溶液和50%甲醇溶液為溶劑,分別采取超聲 15、30、45 min提取方法處理樣品,比較發(fā)現(xiàn)5種成分在80%甲醇溶液中均較穩(wěn)定,提取效果好,雜質(zhì)干擾少。而采用80%甲醇溶液超聲15 min已經(jīng)將樣品中的5種活性成分提取完全,且節(jié)約時(shí)間,操作簡(jiǎn)便。使用本法測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,基線平穩(wěn),可有效地控制養(yǎng)肝解毒丸的質(zhì)量。

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