王元欣 岳康異 魚洋 武秀權(quán) 孫季冬 張磊*

(1扶風縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 寶雞 722200; 2空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

作為一種嚴重影響人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，帕金森病(Parkinson's disease, PD)的發(fā)病率越來越高，大量研究提示其發(fā)病主要與中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元代謝異常有關(guān)，但具體病理機制尚不清楚[1]。新近發(fā)現(xiàn)的線粒體表達分子沉默信息調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子3(silent information regulator transcription3, SIRT3)，在大腦等代謝活躍的組織高表達，是神經(jīng)元能量代謝和線粒體功能的中心環(huán)節(jié)，在氧化應(yīng)激介導的聽力減退、腫瘤及衰老等起著重要的細胞保護作用[2-3]，但其是否參與PD發(fā)生發(fā)展還有待研究。文獻報道，維生素C(vitamin C, Vit C)參與維持細胞正常能量代謝、拮抗氧化應(yīng)激、消除自由基等許多重要生理活動[4-5]。但是，有關(guān)Vit C通過何種機制、能否有效治療PD的研究還較少見。腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株是一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，經(jīng)神經(jīng)生長因子誘導分化后，很接近中腦多巴胺能神經(jīng)元所合成的酶類、表達的受體以及合成的神經(jīng)遞質(zhì)[6-7]。因此，本實驗利用PC12細胞系，建立1-甲基-4-苯基-四氫吡啶離子(1-methyl-4-phenyl 1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine, MPP+)致PD體外模型[8]，深入探討Vit C通過調(diào)控SIRT3影響PD細胞模型中PC12細胞自噬的作用機制，為Vit C在PD治療及作用機制方面研究奠定實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要試劑和細胞株

Vit C、MPP+(Sigma公司)，兔源一抗SIRT3、LC3B、β-actin(Abcam公司)，鼠源一抗LC3B(武漢三鷹)；山羊抗兔IgG/辣根酶標記二抗(中杉金橋)；驢抗兔熒光二抗、驢抗鼠熒光二抗(Thermo公司)；細胞增殖-毒性檢測試劑盒(cell counting Kit-8，CCK-8)由武漢博士德生物工程有限公司提供；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。PC12購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

二、PC12細胞培養(yǎng)

PC12細胞經(jīng)復蘇、培養(yǎng)和擴增后，誘導其向交感神經(jīng)元樣細胞分化：取傳五代以上PC12細胞，經(jīng)消化分散后，制成5×105c/mL細胞懸液，接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

三、MPP+致PD體外模型的制作及分組

取形態(tài)類似于交感神經(jīng)元的PC12細胞，對照組不做任何處理，Vit C組加入400 μmol/L Vit C孵育， Vit C+MPP+組加入400 μmol/L Vit C孵育6 h后加入700 μmol/L MPP+，MPP+組加入700 μmoL MPP+繼續(xù)孵育48 h，體外模擬帕金森病的神經(jīng)損傷。

四、CCK-8試劑盒檢測細胞活力

96孔板以3 000 c/孔的密度接種PC12細胞，處理同上，每100 μL培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱37 ℃下孵育1～4 h，酶標儀法450 nm檢測吸光度。

五、LDH試劑盒檢測

按照說明書，酶標儀波長490 nm。以標準品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、0 U/L為橫坐標，吸光度值為縱坐標，作標準曲線。取上述4組細胞培養(yǎng)液，根據(jù)樣品吸光度值在該曲線圖上查出相應(yīng)LDH含量。

六、WB檢測LC3-Ⅱ和SIRT3表達

接種6孔板，分組及處理同上，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，和LC3B(1 ∶ 3 000)、SIRT3(1 ∶ 500)與β-actin(1 ∶ 3 000)抗體結(jié)合，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗結(jié)合，壓片后顯色后照相。最后用Gel-Pro analyzer軟件進行灰度掃描分析。以目的蛋白與β-actin的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對量。并進行掃描圖像分析儀計算蛋白條帶的表達[9]。

七、免疫熒光檢測LC3-Ⅱ、SIRT3表達

用4%多聚甲醛固定20 min后，將爬片固定載玻片上，0.5 % tritonX-100 通透10 min，驢血清室溫封閉1 h，按比例加入鼠源一抗抗體(LC3 1 ∶ 50)、兔源一抗抗體(SIRT3 1 ∶ 400)，4 ℃過夜，驢抗兔熒光二抗抗體(1 ∶ 1 000)和驢抗鼠熒光二抗抗體(1 ∶ 1 000)室溫孵育3 h，洗滌后，Hoechst 染料染核10 min，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察后拍片。

八、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、PC12細胞CCK-8活力檢測

各組與對照組相比，細胞活力差異明顯(P<0.01)。單純Vit C組較對照組活力增加約5.88%，MPP+組細胞存活率為48.23%±0.33%，Vit C+MPP+組細胞存活率增高至63.97%±0.65%，兩組間有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。

圖1 各組PC12細胞活力

Fig 1 Effect of Vit C on cell viability of MPP+-treated PC12 cells

aP<0.01,vsControl group;bP<0.01,vsMPP+group.

二、PC12細胞LDH檢測結(jié)果

MPP+組與Vit C+MPP+組中LDH含量差異明顯(P<0.01)。而與MPP+組LDH含量比較(165.200±5.946)U/L相比，Vit C+MPP+組PC12細胞培養(yǎng)液中的LDH含量(130.400±6.589)U/L減少，兩組間有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 各組LDH檢測

Fig 2 LDH activity in each group

aP<0.01,vsControl group;bP<0.01,vsMPP+group.

三、WB檢測PC12細胞LC3-Ⅱ和SIRT3表達的變化

對照組和Vit C組中LC3-Ⅱ、SIRT3少量表達，之間無統(tǒng)計學差異。與MPP+組比較，Vit C + MPP+組SIRT3和自噬標志分子LC3-Ⅱ表達顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

四、免疫熒光檢測PC12細胞LC3-Ⅱ和SIRT3表達的結(jié)果

對照組中LC3-Ⅱ、SIRT3少量表達。與MPP+組比較，Vit C+MPP+組中中自噬相關(guān)分LC3-Ⅱ點狀熒光表達增多、增強，SIRT3表達亦成斑點狀、熒光強度顯著增高，見圖4。

圖3 Western Blot檢測LC3-Ⅱ和SIRT3蛋白在各組中的表達變化

Fig 3 The expression of LC3-Ⅱand SIRT3 protein in each group detected by Western Blot

A: Statistical representation for the expression of LC3-II; B: Statistical representation for the expression of SIRT3.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsMPP+group.

圖4 熒光顯微鏡檢測LC3-Ⅱ、SIRT3的表達(×400)

Fig 4 LC3-Ⅱand SIRT3 in of MPP+treated PC12 cell detected by immunofluorescense microscopy (×400)

討 論

最新研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和自我“清除”功能退化等多因素病因與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是PD發(fā)病的核心機制。首先，Xu等[10]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-Nrf2被調(diào)控線粒體自噬的DJ-1蛋白抑制，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用；而一些對多巴胺能神經(jīng)元起神經(jīng)保護作用的分子，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)歸[11]。其次，在人類和動物，線粒體復合物I抑制劑可導致PD，Alvarez-Erviti等發(fā)現(xiàn)PD患者的黑質(zhì)和杏仁核線粒體自噬功能有缺陷或退化[12]。而過度的線粒體應(yīng)激或PINK1/2基因突變患者容易發(fā)生線粒體損傷累積，導致氧化應(yīng)激和毒素累積損傷增加，引起多巴胺能神經(jīng)元死亡繼而引發(fā)PD[13]。綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體自噬在PD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，但具體分子病理機制仍不明確。

SIRT3主要位于線粒體，在大腦等代謝活躍的組織高表達，是神經(jīng)元能量代謝和線粒體功能的中心環(huán)節(jié)[14]。本研究中，Vit C在上調(diào)SIRT3的同時，也影響自噬相關(guān)分子LC3-Ⅱ的表達，增加PC12細胞自噬的發(fā)生，提示SIRT3和LC3-Ⅱ在表達上存在正相關(guān)，但具體作用機制還有待更深入研究。

Vit C是一種廣譜抗氧化物，Engelhart等[15]通過大樣本調(diào)查，發(fā)現(xiàn)Vit C可以顯著減低癡呆癥的患病率，但其具體機制甚不明了。后來Berzina[16]等發(fā)現(xiàn)，Vit C可拮抗炎癥反應(yīng)，還能維持氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而發(fā)揮治療雞腸膜炎作用。而本研究的CCK-8細胞活力檢測和LDH含量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Vit C可以增強細胞自身活力，顯著降低LDH漏出率，且具有較好的減輕損傷，保護PC12細胞的作用。Western-Blot檢測LC3-Ⅱ的結(jié)果提示我們MPP+損傷可激活細胞自噬水平，但PC12細胞死亡增加，提示MPP+可能通過另外信號通路損傷神經(jīng)細胞，而其激活的細胞自噬等功能活動不足以阻止其損傷作用，從而造成神經(jīng)細胞的損傷，而加入Vit C后，進一步提高PC12細胞的自噬水平，達到清除損傷因素，發(fā)揮保護細胞維持正常生理功能，拮抗PD的神經(jīng)損傷；深入研究發(fā)現(xiàn)，Vit C亦可能通過顯著增加SIRT3表達，減輕MPP+損傷后的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而免疫熒光結(jié)果顯示，在MPP+損傷后SIRT3和LC3-ⅡC存在共定位，Vit C可以顯著提高兩者表達。鑒于SIRT3在PD模型中有保護神經(jīng)元的作用[17]，而Vit C可以激活SIRT3和提高細胞自噬水平，抑制細胞損傷，表明兩者在拮抗PD的病理生理過程中發(fā)揮重要保護作用。在下一步實驗中，我們將通過慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)和下調(diào)SIRT3表達，以期闡明VitC如何通過調(diào)控SIRT3影響細胞自噬水平的分子信號機制。