楊惠寬， 苑召虎， 陳小潔， 魏亞明， 諶丹丹

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院輸血科，廣東 廣州 510180；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院放射科，廣東 廣州 510180）

T細(xì)胞激活抑制物免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA）是一種新發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)節(jié)調(diào)控點(diǎn)，類似于程序性死亡受體-配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）。最新的研究結(jié)果顯示，由VISAT信號活化引起的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮了重要作用[1]。VISTA抗原在髓系造血細(xì)胞和Foxp3+CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞表面呈高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞表面不表達(dá)；抗VISTA單克隆抗體與VISTA抗原結(jié)合后可阻斷VISTA信號活化引起的免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)，增加外周血中特異性腫瘤T細(xì)胞，同時增強(qiáng)其在腫瘤微環(huán)境中的滲透能力及增殖、殺傷活性[2-3]。樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（dendritic cell-cytokine-induced killer cell，DC-CIK）是一種體外誘導(dǎo)的、有特異性殺傷活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞，富含VISTA抗原陽性的Foxp3+CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞，可通過釋放細(xì)胞內(nèi)的穿孔素、顆粒酶等活性物質(zhì)及Fas-FasL途徑有效殺傷多種血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞、清除放化療或骨髓移植后體內(nèi)殘余病灶和微小病灶、預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[4-5]。本研究擬通過對DC-CIK表面VISTA抗原的封閉阻斷來抑制VISTA信號活化引起的免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)，以期增加DC-CIK對惡性腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。

1 材料和方法

1.1 DC-CIK的培養(yǎng)及鑒定

用Ficoll分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）分離供者單個核細(xì)胞，取外周血單個核細(xì)胞層，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌并重懸后，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)75 min，貼壁細(xì)胞加入G70-7551無血清培養(yǎng)基（日本TAKARA公司）進(jìn)行樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）培養(yǎng)；懸浮細(xì)胞加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cell，CIK）培養(yǎng)基進(jìn)行CIK培養(yǎng)；培養(yǎng)至第8天，將腫瘤抗原刺激的DC與上述CIK共培養(yǎng)，培養(yǎng)至第14天，產(chǎn)生一種有特異性腫瘤殺傷活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞，即DC-CIK。鑒定：細(xì)胞活率＞95%；細(xì)菌、真菌、支原體、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）及細(xì)菌內(nèi)毒素檢測全部陰性；CD3+CD56+細(xì)胞＞20%，CD3+CD4+細(xì)胞＜15%，CD3+CD8+細(xì)胞＞50%，CD86+細(xì)胞＞5%， 與文獻(xiàn)報道[5]一致。

1.2 DC-CIK與抗VISTA抗體的結(jié)合率

培養(yǎng)成熟并鑒定合格后的DC-CIK 800×g離心5 min，棄上清；PBS洗滌2次后，用PBS重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106個/mL。取上述細(xì)胞懸液1 mL，分別加入1、2 和4 μL兔源性抗VISTA單克隆抗體（美國Abcam公司），即體積比分別為1 000∶1、500∶1、250∶1。室溫下孵育2 h，PBS洗滌2次后，加1 mL PBS重懸，然后加入2 μL Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體（美國Abcam公司），室溫下避光孵育1 h。PBS洗滌并重懸，3 h內(nèi)采用LSRFortessa流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測。

1.3 抗VISTA抗體對DC-CIK殺傷活性的影響

用含10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）的培養(yǎng)基將效應(yīng)細(xì)胞（DC-CIK）濃度調(diào)整至1×106個/mL，靶細(xì)胞[人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562（南京凱基生物技術(shù)有限公司）]濃度調(diào)整至50 000和100 000個/mL，分別取100 μL加入相應(yīng)96孔板中，即效靶比例為20∶1、10∶1，邊緣孔用無菌PBS填充。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT] （美國Sigma公司）溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT，用無菌PBS配置），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜（美國Sigma公司），置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。采用SpectraMax iD5多功能微孔讀板機(jī)（美國Molecular Devices公司）測定490 nm處各孔的吸光度（A）值。殺傷活性（%）=[（靶細(xì)胞孔A值+效應(yīng)細(xì)胞孔A值-實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孔A值）/靶細(xì)胞孔A值]×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DC-CIK與抗VISTA抗體的結(jié)合率

當(dāng)DC-CIK與抗VISTA抗體的體積比分別為1 000∶1、500∶1、250∶1時，VISTA陽性的DCCIK比例分別為（9.96±0.54）%、（9.98±0.37）%和（10.26±0.57）%，三者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。即使進(jìn)一步增加抗VISTA抗體的濃度也無法增加二者的結(jié)合率。見圖1。

圖1 DC-CIK與抗VISTA抗體不同體積比時DC-CIK表面VISTA抗原的表達(dá)情況

2.2 VISTA信號阻斷后DC-CIK殺傷活性的變化

將未經(jīng)處理的DC-CIK作為對照組，將用抗VISTA抗體處理的DC-CIK作為實(shí)驗(yàn)組。對K562細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果顯示，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞為10∶1和20∶1時，實(shí)驗(yàn)組DC-CIK的殺傷活性分別為（77.3±6.8）%和（92.8±5.9）%，均明顯高于對照組[（68.4±4.0）%、（81.8±5.4）%]（P＜0.01）。

2.3 VISTA信號阻斷后DC-CIK增殖的變化

孵育處理54 h后，對照組的細(xì)胞數(shù)由1.00×106個/mL增加至（2.32±0.31）×106個/mL，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)由1.00×106個/mL增加至（3.14±0.48）×106個/mL。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組（P＜0.01），為對照組的1.35倍。見圖2。

圖2 抗VISTA抗體對DC-CIK增殖的影響

2.4 阻斷VISTA信號對DC-CIK分化的影響

實(shí)驗(yàn)組DC-CIK中CD3+CD56+自然殺傷性T（natural killer T，NKT）細(xì)胞（DC-CIK中的主要效應(yīng)細(xì)胞）百分比為（35.12±2.13）%，明顯高于對照組[（21.35±1.32）%]（P＜0.01）。見圖3。

圖3 VISTA抗體處理對DC-CIK分化的影響

3 討論

細(xì)胞免疫治療是除手術(shù)、放療及化療外一種新發(fā)展的治療技術(shù)，被美國《Science》雜志評為2013年排名第一的重大科學(xué)發(fā)現(xiàn)。然而，腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸使得多種惡性腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫效應(yīng)細(xì)胞的識別和攻擊，得以在體內(nèi)繼續(xù)生存和增殖，成為細(xì)胞免疫治療面臨的主要挑戰(zhàn)[6-7]。最新的研究結(jié)果顯示，VISTA信號的阻斷可通過降低腫瘤微環(huán)境中髓系來源的單個核細(xì)胞和增加活化的樹突狀細(xì)胞來改變腫瘤微環(huán)境的抑制性特征；此外，VISTA信號的阻斷還可減少Foxp3+CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的存在，抑制Foxp3+CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫抑制活性[1，8]。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗VISTA抗體可促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖、活化及一系列細(xì)胞因子[干擾素-γ（interferon gamma，INF-γ）、白細(xì)胞介素-2（interleukin 2，IL-2）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等]的分泌，解除T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞攻擊的束縛，顯著提升免疫系統(tǒng)的腫瘤殺傷活性，可使腫瘤大幅萎縮[8-9]。

DC-CIK是一個新型的免疫活性細(xì)胞群體，是將人外周血單個核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子（抗CD3抗體、IL-2、IFN-γ等）誘導(dǎo)擴(kuò)增一段時間后獲得的一群異質(zhì)性細(xì)胞，其中 CD3+CD56+NKT細(xì)胞和CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞在對腫瘤細(xì)胞的殺傷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。采用DC-CIK進(jìn)行細(xì)胞免疫治療可迅速緩解白血病患者的臨床癥狀，大大延長晚期白血病患者的帶瘤生存時間并改善其生存質(zhì)量（如增加食欲、改善睡眠、增強(qiáng)體質(zhì)等）[9]。雖然DC-CIK免疫治療可有效殺傷多種血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞，然而腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸及機(jī)體免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)嚴(yán)重限制了DC-CIK臨床療效的發(fā)揮[5，10]。因此，一種既有特異性腫瘤殺傷活性，又能抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞將更有利于殺傷和清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，抑制其免疫逃逸。本研究結(jié)果顯示，抗VISTA抗體可特異性地結(jié)合于DC-CIK表面，因抗原抗體的結(jié)合具有一定的特異性，因此抗體的結(jié)合情況亦反映了DC-CIK表面VISTA抗原的表達(dá)情況。腫瘤細(xì)胞可通過VISTA信號活化引起的DC-CIK免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)發(fā)生免疫逃逸?？筕ISTA抗體與其抗原結(jié)合后可阻斷由VISTA信號活化引起的免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)，增加外周血中特異性腫瘤T細(xì)胞的數(shù)量，并增強(qiáng)其在腫瘤微環(huán)境中的滲透能力、增殖能力及殺傷活性[2]。本研究結(jié)果顯示，抗VISTA抗體誘導(dǎo)可顯著促進(jìn)DC-CIK的增殖；此外，抗VISTA抗體體外誘導(dǎo)還可以提高DC-CIK中有效殺傷細(xì)胞（CD3+CD56+NKT細(xì)胞）的比例。

與傳統(tǒng)的放療和化療藥物的作用機(jī)制不同，抗VISTA抗體不是通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，而是間接通過增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性來發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。 然而，對于免疫缺陷或自身免疫力低下的患者，新型抗腫瘤免疫制劑藥效的發(fā)揮將大大受限，而且大部分腫瘤患者由于長期進(jìn)行放化療，嚴(yán)重?fù)p傷了自身免疫系統(tǒng)，限制了抗腫瘤免疫制劑藥效的發(fā)揮。經(jīng)抗VISTA抗體處理的DC-CIK可通過在體外擴(kuò)大培養(yǎng)，使其細(xì)胞數(shù)目增至體內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的數(shù)百倍以上，不僅可以顯著增加患者特異性抗腫瘤殺傷細(xì)胞的數(shù)量，彌補(bǔ)其自身免疫力低下的缺陷，而且還可以抑制由VISTA信號活化引起的腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

總之，本研究揭示了抗VISTA抗體增強(qiáng)DCCIK殺傷腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制，以期能提高細(xì)胞免疫治療技術(shù)對頑固性血液系統(tǒng)疾病的療效和臨床應(yīng)用價值。