李德靈

無限極（中國）有限公司

前言

隨著我國人口的老齡化，保健產(chǎn)品的市場前景廣闊，尤其以提高免疫能力相關的產(chǎn)品。因此，相關產(chǎn)品的開發(fā)也吸引了大量關注。劉麗春等[ ]的研究表明歸元口服液可以提高小鼠免疫及具有抗疲勞作用。徐培元等[ ]驗證了降醇護肝口服液可增強小鼠抗疲勞能力，可增強小鼠細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫功能。劉昌衡等[ ]通過實驗驗證了復方海參口服液具有抗疲勞和免疫功能。佟立君等[ ]驗證了松茸濃縮口服液對小鼠的免疫調節(jié)能力和抗疲勞能力有不同程度的改善作用。無限極（中國）有限公司以何首烏、巴戟天、枸杞子、核桃肉、金櫻子、山萸肉及豆肽等，用科學方法精制而成的一款口服液。其中的中藥材何首烏、巴戟天、枸杞子、金櫻子和山萸肉等由于含有多種功能活性成分，均被報道有增強免疫的功能[ -16]。這種復合口服液是否也具有增強免疫的功能未見研究報道。

本研究擬對該復合口服液產(chǎn)品進行增強免疫的功能進行研究，為日后該口服液的推廣奠定理論數(shù)據(jù)依據(jù)。

1.材料與儀器

ICR小鼠雌性，SPF級，體質量（20±2）g；昆明小鼠雄性，清潔級，體質量（20±2）g，由暨南大學醫(yī)學動物中心提供。

無限極男士口服液，無限極（中國）有限公司提供。脫纖維羊血，2%壓積綿羊紅細胞（SRBC），刀豆蛋白(ConA)，RPMI1640培養(yǎng)液，噻唑蘭（MTT）,均購自廣州市齊云生物科技有限公司。異丙醇，Na2CO3溶液等試劑均為分析純。

全自動細胞計數(shù)儀，CO2培養(yǎng)箱，酶聯(lián)免疫檢測儀，離心機。

2.實驗方法

2.1 動物飼養(yǎng)、分組及劑量

取SPF級ICR小鼠252只，雌性，體重18～22 g，分成3批進行試驗，分別進行遲發(fā)型變態(tài)反應實驗（DTH）和血清溶血素實驗，碳粒廓清實驗，小鼠脾淋巴細胞轉化實驗和NK細胞活性測定實驗。每批小鼠均分成7組，每組12只，分別為：陰性對照組，口服液低、中、高劑量組（2.5、5.0、15.0mL/kg·BW）。適應性喂養(yǎng)3天后正式試驗，連續(xù)給藥30天。

2.2 遲發(fā)型變態(tài)反應實驗（DTH）[17]

取新鮮的脫纖維羊血，生理鹽水洗滌3次（1000 rpm，10 min），每只小鼠腹腔注射2%壓積綿羊紅細胞（SRBC）0.2mL，致敏后4 d，測量左后小鼠足趾厚度，同一部位測量三次，取平均值。然后在測量部位用20μL 20%的SRBC進行第二次免疫，24 h后測量相同部位厚度，計算二次免疫前后足趾厚度差值，判定結果。

2.3 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗[18]

無菌取脾，置于盛有適量（3-5ml）無菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10 min（1000 r/min）。然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞，調整細胞濃度為3×106個/mL。

將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，一孔加75μL的ConA液（相當于7.5μg/mL），另一孔作為對照，置于5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5mg/mL）50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，人工吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570 nm波長測定光密度值。

用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結果陽性。

2.4 血清溶血素抗體積數(shù)的測定[16]

試驗第26-27天，將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進行免疫。第31天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，3000 r/min離心10 min，收集血清。取U型底的96孔板每孔加入100μL PBS緩沖液，然后在第一孔加入100μL小鼠血清吹打均勻，再從第一孔取100μL到第二孔吹打均勻，再從第二孔取100μL到第三孔吹打均勻，以此類推進行2倍稀釋，最后一孔取出100μL棄去，每孔加入100μL 0.5%(v/v)的SRBC懸液（SA稀釋），混勻，放入生化培養(yǎng)箱 37℃ 溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度，計算抗體積數(shù)。

2.5 NK細胞活性測定[19]

實驗前24h將靶細胞進行傳代培養(yǎng)。應用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為4×105個/mL。

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10 min（1000r/min）。棄上清將細胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水20秒，裂解紅細胞后再加入0.5 mL 2倍Hank's 液及8mLHank's 液，1000 rpm，10 min離心，然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞；最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×107個/mL。

取靶細胞和效應細胞各100μL（效靶比50:1），加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100μl，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1% NP40各100μL；上述各項均設三個復孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質液100μL，反應3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶標儀490nm處測定光密度值（OD）。

按下式[19]計算NK細胞活性，受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性，即可判定該項實驗結果陽性。

2.6 碳粒廓清實驗[20]

所有小鼠通過尾靜脈注射0.2 mL稀釋印度墨汁，計時2、10 min，分別取小鼠內(nèi)眥靜脈血20 μL加入到2 mL0.1%Na2CO3溶液防止發(fā)生凝集。以0.1%的Na2CO3溶液作為空白對照，在600 nm波長處測OD值。t1表示1min，t2表示10 min，OD1表示1 min所取靜脈血的光密度值，OD2表示10 min所取靜脈血的光密度值。

頸椎脫臼處死小鼠，解剖，取肝臟和脾臟稱重記錄，按下式計算吞噬指數(shù)a。

k = ( lgOD1- lgOD2) / ( t2-t1)

3.實驗結果

3.1 口服液對小鼠體重和臟器的影響

圖3-1 攝入口服液后小鼠的初重、末重

由圖3-1可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，其體重在各劑量組與陰性對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3-2 攝入口服液后小鼠的脾臟、胸腺指數(shù)

由圖3-2可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30 d，其脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)在與陰性對照組間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

3.2 口服液對小鼠細胞免疫功能的影響

小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）結果如圖3-3所示，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30d，與陰性對照組比較，攝入口服液的低劑量組有顯著性差異（P＜0.05）。小鼠脾淋巴細胞轉化試驗結果如圖3-4所示，攝入口服液的三個劑量組小鼠均較陰性對照組極顯著提高小鼠脾臟淋巴細胞的增殖能力（P＜0.01）。實驗結果表明，該口服液對小鼠的遲發(fā)型變態(tài)和脾淋巴細胞轉化增殖有明顯的增強和促進作用，能夠提高小鼠的細胞免疫功能。

圖3-3 口服液對小鼠的足趾厚度差值的影響

圖3-4 攝入口服液后小鼠淋巴細胞轉化能力的影響

3.3 口服液對小鼠的體液免疫功能的影響

口服液對抗體積數(shù)的影響結果如圖3-5所示，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30d，與陰性對照組比較，攝入口服液的高劑量組有極顯著性差異（P＜0.01）。說明其對小鼠的體液免疫功能有增強作用 。

圖3-5 攝入口服液后小鼠抗體積數(shù)的影響

3.4 口服液對NK細胞活力的影響

小鼠NK細胞活力實驗結果如圖3-6所示。攝入口服液的三個劑量組較陰性對照組均能顯著提升小鼠淋巴細胞的增殖能力（P＜0.05或P＜0.01）。其中的低劑量組與陰性對照組相比具有極顯著差異（P＜0.01），效果更顯著。說明該口服液產(chǎn)品能增強NK細胞活力。

圖3-6 口服液對小鼠NK細胞活力的影響

3.5 口服液對小鼠單核-巨噬細胞碳粒廓清能力的影響

圖3-7 口服液對小鼠吞噬指數(shù)的影響

由圖3-7可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30d，與陰性對照組比較，各劑量組圖吞噬指數(shù)均有所提高，經(jīng)統(tǒng)計學處理，高劑量組差異極顯著（P＜0.01）。說明口服液產(chǎn)品能夠一定程度上增強小鼠單核-巨噬細胞功能。

4.結論

本次研究所測驗的口服液是以何首烏、巴戟天、枸杞子、金櫻子及山萸肉等，用科學方法精制而成。

本研究中通過小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應試驗、小鼠脾淋巴細胞轉化試驗 (MTT法)、小鼠血清溶血素滴度測定 (血凝法)、NK細胞活性測定和碳粒廓清實驗, 發(fā)現(xiàn)口服液產(chǎn)品具有明顯的增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應、促進小鼠脾 淋巴細胞轉化增殖、增加小鼠血清溶血素滴度水平、增強NK細胞活力和增強小鼠單核-巨噬細胞功能。試驗結果表明口服液產(chǎn)品能夠提高小鼠的細胞免疫和體液免疫功能等，對小鼠的免疫功能有正向調節(jié)作用 。