云南省藥物研究所/云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

山皮條為瑞香科Thymelaeaceae植物WikstroemiadolichanthaDiels，別名矮陀陀、竹臘皮。落葉小灌木，葉卵形或橢圓形，主根長(zhǎng)圓錐形，有支根及少量須根，藥用部分為其根皮。味辛、辣，微苦，性微溫[1]。主要分布于四川、云南、貴州等地，多生長(zhǎng)于石灰?guī)r地帶的向陽山坡上[2]。《滇南本草》中記載：山皮條“治婦人氣逆，肚腹疼痛，寬中理氣，胸膈肚腹膨脹，止面寒梗硬脹痛”。《昆明民間常用草藥》中亦記載：山皮條“寬中理氣，解郁，除瘡毒。治肚腹冷痛，胸膈氣脹，癆熱，瘡毒?！泵耖g亦多用其治惡瘡[2]。據(jù)此推斷山皮條具有鎮(zhèn)痛、抗炎之功效。實(shí)驗(yàn)對(duì)山皮條水提物進(jìn)行小鼠灌胃給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察其安全性，采用醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)和二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)分別考察其鎮(zhèn)痛、抗炎作用，為山皮條水提物的臨床安全及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，周齡4～6周，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。飼養(yǎng)條件：室溫為(25±2)℃，相對(duì)濕度40%～70%，塑料盒群養(yǎng)。喂SPF大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，自由飲水和進(jìn)食。飼料生產(chǎn)于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0010。

1.2 藥品與試劑 山皮條水提物(批號(hào)：20151019，淺棕色粉末，提取率18.2%，云南省藥物研究所化學(xué)研究室)。羧甲基纖維素鈉(批號(hào)：20160602，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；阿司匹林腸溶片(批號(hào)：BJ22649，Bayer Schering Pharma公司)；乙酸(批號(hào)：1202101，上海申博化工有限公司)；生理鹽水(批號(hào)：A150413 G2，昆明南疆制藥有限公司)；二甲苯(批號(hào)：20140701，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)。

1.3 儀器 JJ-2000 型電子天平(美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；PL-203型電子分析天平(METTER-TOLEDO(上海)有限公司)；ELGALA 613型超純水機(jī)(英國(guó)ELGA LabWater/VWS(UK)Ltd )。

2 方法

2.1 小鼠灌胃給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)[3]

2.1.1 預(yù)試驗(yàn) 山皮條水提物能配制較高且利于小鼠灌胃的混懸液的濃度為0.5 g/mL(20.00 g/kg·bw)，以0.8倍作為劑量設(shè)置比，共設(shè)四個(gè)劑量，分別為20.00 、16.00、12.80、10.24 g/kg·bw劑量組(分別相當(dāng)于生藥109.89、87.91、70.33、56.26 g/kg·bw)。取SPF 級(jí)昆明種小鼠16 只，體重18～22 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水6 h，隨機(jī)分為4組，每組4只，雌雄各半，以灌胃最大容積40 mL/kg·bw分別灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，觀察動(dòng)物一般癥狀及死亡情況，連續(xù)觀察7 d。

2.1.2 LD50實(shí)驗(yàn) 根據(jù)小鼠灌胃給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將山皮條水提物設(shè)置6個(gè)劑量組，即24.00、20.40、17.34、14.74、12.53、10.65 g/kg·bw(分別相當(dāng)于生藥131.87、112.09、95.27、80.99、68.85、58.52 g/kg·bw)，另設(shè)溶媒對(duì)照組(0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)。

取SPF 級(jí)昆明種小鼠70只，體重18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，即溶媒對(duì)照組和不同劑量山皮條水提物組，每組10只，雌雄各半。小鼠禁食不禁水6 h后，山皮條水提物各劑量組按40 mL/kg體積灌胃給予相應(yīng)供試品，溶媒對(duì)照組灌胃給予相同容積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，觀察給藥后小鼠急性毒性反應(yīng)、死亡情況、攝食量、二便、體重等情況，以后每天至少觀察1次，連續(xù)觀察14 d。對(duì)觀察期死亡的動(dòng)物進(jìn)行解剖，觀察結(jié)束后脫頸椎處死存活的動(dòng)物，大體解剖觀察各臟器、器官的體積、顏色、質(zhì)地等有無異常。

2.2 醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)[4]取SPF 級(jí)昆明種小鼠60只，體重18～22 g ，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，即模型對(duì)照組、阿司匹林組(400 mg/kg·bw)、山皮條水提物低、中、高劑量組(劑量分別為1.58、3.15、6.30 g/kg·bw)，每組12只。模型對(duì)照組按20 mL/kg體積灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組按20 mL/kg的體積灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，按10 mL/kg體積腹腔注射0.6%的冰醋酸溶液(純水配制)，記錄注射后15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)(腹部?jī)?nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高)的次數(shù)，并按下式計(jì)算其扭體抑制率：

扭體抑制率(%)=(1-給藥組扭體次數(shù)/模型對(duì)照組扭體次數(shù))×100%。

2.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)[5]取SPF 級(jí)昆明種小鼠60只，體重18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，即模型對(duì)照組、阿司匹林組(400 mg/kg·bw)、山皮條水提物低、中、高劑量組(劑量分別為1.58、3.15、6.30 g/kg·bw)，每組12只。模型對(duì)照組小鼠按20 mL/kg體積灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組按20 mL/kg的體積灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，各組小鼠于右耳耳廓兩面按0.05 mL/只均勻涂抹二甲苯，左耳不做處理為對(duì)照。造模1 h后，脫頸椎處死各組動(dòng)物，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑6 mm的打孔器于雙耳同一部位切下等面積耳片，立即稱重，按下式計(jì)算耳腫脹度和腫脹抑制率： 耳腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量 腫脹抑制率=(模型對(duì)照組平均腫脹度- 給藥組平均腫脹度)/模型對(duì)照組平均腫脹度×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)的方式表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析比較組間數(shù)據(jù)，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠灌胃給藥急性毒性實(shí)驗(yàn) 小鼠灌胃給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)中，20.00、16.00、12.80、10.24 g/kg·bw劑量組死亡動(dòng)物數(shù)分別為4只、2只、1只、0只，死亡率分別為100%、50%、25%、0%。各組小鼠給藥后主要出現(xiàn)俯臥、腹瀉、翻正反射消失等中毒癥狀，直至死亡。死亡動(dòng)物解剖觀察，發(fā)現(xiàn)全部動(dòng)物出現(xiàn)肺部充血現(xiàn)象。

正式實(shí)驗(yàn)中，小鼠灌胃給予山皮條水提物后，在0.5～4 h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為俯臥、腹瀉、抽搐、翻正反射消失等癥狀直至死亡。動(dòng)物給藥后49 min開始有小鼠死亡，死亡時(shí)間集中在給藥后48 h內(nèi)，對(duì)死亡動(dòng)物解剖觀察，全部動(dòng)物出現(xiàn)肺部充血現(xiàn)象，但未進(jìn)一步進(jìn)行病理檢測(cè)。毒性反應(yīng)癥狀發(fā)生時(shí)間和程度隨給藥劑量的降低而減輕，死亡動(dòng)物數(shù)也相應(yīng)減少。剩余小鼠行為活動(dòng)逐漸趨于正常，至給藥第3天恢復(fù)，試驗(yàn)期間，各組存活小鼠體重均持續(xù)增長(zhǎng)。各組動(dòng)物的毒性癥狀和死亡數(shù)量見表1。

觀察期結(jié)束后脫頸椎處死存活的動(dòng)物，進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃、腸及胸腔、腹腔，各臟器、器官的體積、顏色、質(zhì)地等均無肉眼可見的異常。

在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)條件和劑量范圍內(nèi)，山皮條水提物24 h內(nèi)小鼠灌胃給藥LD50為15.48 g/kg·bw(相當(dāng)于生藥85.05 g/kg·bw)，95%的可信區(qū)間為14.07～16.99 g/kg·bw(相當(dāng)于生藥量77.31～93.35 g/kg·bw)。

表1 山皮條水提物小鼠灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)各組動(dòng)物毒性癥狀及死亡數(shù)

3.2 醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn) 山皮條水提物以1.58、3.15、6.30 g/kg·bw(相當(dāng)于生藥8.68、17.31、34.62 g/kg·bw)的劑量(給藥劑量由小鼠灌胃給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)及藥效實(shí)驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)得出)連續(xù)灌胃給藥7 d，與模型對(duì)照組比較，山皮條水提物3.15 g/kg·bw、6.30 g/kg·bw劑量組均能顯著減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示山皮條水提物具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，見表2。

表2 山皮條水提物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(n=12，±SD)

注：與模型對(duì)照組比較，**P<0.01,***P<0.001。

3.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 山皮條水提物以1.58、3.15、6.30 g/kg·bw g(相當(dāng)于生藥8.68、17.31、34.62 g/kg·bw)的劑量連續(xù)灌胃給藥7 d，與模型對(duì)照組比較，6.30 g/kg·bw劑量組能顯著降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示山皮條水提物具有抗炎的作用，見表3。

表3 山皮條水提物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(n=12，x±SD)

注：與模型對(duì)照組比：**P<0.01。

4 討論

山皮條盛產(chǎn)于云南、四川等地，《滇南本草》中記載其主治肚腹疼痛，能止面寒梗硬脹痛[1]，民間亦多用其除瘡毒，治肚腹冷痛[6]，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其藥理作用的報(bào)道較少，杜仕榕[2]對(duì)山皮條的臨床應(yīng)用加以整理，將其佐以其他藥材治療慢性副鼻竇炎、尿路感染、乳腺炎等多種疾病，能清熱敗火、消炎祛毒，臨床療效確切。本實(shí)驗(yàn)對(duì)山皮條水提物進(jìn)行小鼠灌胃給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察其安全性，采用醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)和二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)分別觀察其鎮(zhèn)痛、抗炎作用。

在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，小鼠灌胃給予山皮條水提物后，在0.5～4 h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為俯臥、腹瀉、抽搐、翻正反射消失等癥狀直至死亡，死亡動(dòng)物全部出現(xiàn)肺部充血現(xiàn)象，由此推測(cè)山皮條對(duì)小鼠毒性作用可能涉及中樞神經(jīng)、自主神經(jīng)、肌肉及肺部等，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。試驗(yàn)期間，各組存活小鼠體質(zhì)量均持續(xù)增長(zhǎng)，但由于動(dòng)物死亡較多，未對(duì)存活小鼠體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。山皮條水提物24 h內(nèi)小鼠單次灌胃給藥LD50為15.48 g/kg·bw(相當(dāng)于生藥85.05 g/kg·bw)，95%的可信區(qū)間為14.07～16.99 g/kg·bw(相當(dāng)于生藥量77.31～93.35 g/kg·bw)，其毒性反應(yīng)癥狀發(fā)生時(shí)間和程度隨給藥劑量的降低而減輕，死亡動(dòng)物數(shù)量也相應(yīng)減少，顯示出劑量-反應(yīng)關(guān)系。提示山皮條具有一定的毒性，在臨床使用中要嚴(yán)格掌握其用量，避免使用過量而發(fā)生中毒。

醋酸致小鼠疼痛性扭體模型是目前國(guó)內(nèi)外鎮(zhèn)痛藥物篩選的常用方法[7-8]，主要考察受試藥物的外周鎮(zhèn)痛作用，也適用于中樞鎮(zhèn)痛藥物的藥理研究[9]，適于非甾體抗炎藥鎮(zhèn)痛藥效的篩選[10]。其利用醋酸產(chǎn)生的化學(xué)刺激導(dǎo)致小鼠腹腔持久性疼痛，同時(shí)伴隨急性炎癥反應(yīng)，刺激其臟層和壁層腹膜，引起小鼠疼痛性扭體反應(yīng)[11-13]。結(jié)果表明，山皮條水提物能明顯減少小鼠疼痛性扭體的次數(shù)，具有一定的鎮(zhèn)痛作用。二甲苯是化學(xué)致炎劑，對(duì)皮膚黏膜有較強(qiáng)的刺激作用，能誘導(dǎo)炎性物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加、急性滲出和水腫等，與臨床炎癥癥狀相似，故常用于抗急性炎癥藥物的篩選[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山皮條水提物能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，具有一定的抗炎作用。

綜上，山皮條水提物具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究；但也有一定的毒性，在臨床使用中要嚴(yán)格掌握其用量。