長(zhǎng)福*

1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure,CHF)是器質(zhì)性心臟病的最終結(jié)局，是威脅人類健康的主要疾病之一[1]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生于多種心血管疾病，與心律失常和心臟功能障礙密切相關(guān)，在心力衰竭發(fā)生進(jìn)程中起著關(guān)鍵性的作用[2-3]。

現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)慢性心力衰竭的臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“心悸”“心痹”“心水”“心衰”“胸痹”等疾病范疇，氣滯血瘀是慢性心力衰竭的常見(jiàn)證型[4-5]。理氣活血滴丸，是根據(jù)貴州苗族民間驗(yàn)方結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論研制而成的一種中藥復(fù)方制劑，其成分包括苗藥米槁(又名大果木姜子)、薤白、川芎、冰片，具有溫陽(yáng)寬胸，理氣活血功效，對(duì)心悸、胸悶、胸痛、氣短、形寒等療效顯著，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛等[6]。近年來(lái)本課題組發(fā)現(xiàn)理氣活血滴丸對(duì)再灌注損傷心肌組織具有保護(hù)作用[7-8]，本研究從左心室功能和心肌細(xì)胞凋亡方面探討理氣活血滴丸對(duì)大鼠CHF的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體重(180±20)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0010。

1.2 藥物和試劑 理氣活血滴丸，由貴州益佰制藥股份有限公司提供，批號(hào)：20161002；馬來(lái)酸依那普利片購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司，批號(hào)：20160806；鹽酸異丙腎上腺素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：I8480；大鼠腦鈉尿肽(Brain Natriuretic Peptide, BNP)試劑盒購(gòu)自上海鑫樂(lè)生物科技有限公司，批號(hào)：xl-Er0038；TUNEL染色試劑盒(In situ cell death detection kit-POD法)購(gòu)自瑞士羅氏公司，批號(hào)：10279600。

1.3 儀器 HX-101E小動(dòng)物呼吸機(jī)和BL-420S生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司；RM2016轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司；Thermo全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司；BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

2 方法

2.1 大鼠慢性心力衰竭模型建立及分組 雄性SD大鼠(60只)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(10只)和CHF模型組(50只)。CHF模型組大鼠皮下注射ISO 170 mg/kg/d，連續(xù)注射2 d，每天1次，間隔時(shí)間為24 h，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，持續(xù)誘導(dǎo)4周[9-10]。之后測(cè)定血清BNP含量，模型組大鼠血清中BNP濃度與正常組相比顯著升高，說(shuō)明造模成功。CHF模型大鼠隨機(jī)分為5組：模型組，依那普利組(10 mg/kg/d)，理氣活血滴丸低劑量(43.75 mg/kg/d)、中劑量(87.50 mg/kg/d)、高劑量175.00 mg/kg/d)組，各組大鼠按相應(yīng)劑量每天灌喂給藥1次，連續(xù)給藥4周。對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等容積生理鹽水。

2.2 血清BNP含量測(cè)定 采集大鼠腹主動(dòng)脈血液，4 ℃，2500 r/min離心10 min，取血清，之后按照試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定血清中BNP的含量。

2.3 左心室功能監(jiān)測(cè) 大鼠稱重，腹腔注射20%烏拉坦麻醉后，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。做氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎分離的頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉近心端。在動(dòng)脈壁剪一小口，逆行刺入帶肝素的靜脈穿刺套管針，慢慢退出穿刺針，緩慢推進(jìn)導(dǎo)管至左心室。穿刺套管與壓力換能器連接，接入BL-420S生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)，記錄左心室內(nèi)壓峰值(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

2.4 TUNEL-POD染色法分析大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 切取左心室冠狀面中部心肌組織塊，4%多聚甲醛固定；固定后常規(guī)石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟，37 ℃胰蛋白酶K處理25 min，PBS漂洗3次；切片滴加TUNEL反應(yīng)混合液于暗盒中37 ℃處理1 h，PBS漂洗3次；滴加converter-POD液(連接辣根過(guò)氧化酶的熒光素抗體)，于暗盒中37 ℃處理30 min，PBS漂洗3次；DAB顯色，再蘇木素輕度復(fù)染。然后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。凋亡細(xì)胞核顏色為淺黃色或棕黃色，陰性表達(dá)為藍(lán)色，底色為白色。根據(jù)采集的圖像統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞百分率(AI)：凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

3 結(jié)果

3.1 理氣活血滴丸對(duì)CHF大鼠血清BNP含量的影響 結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中BNP濃度顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，理氣活血滴丸低劑量組大鼠BNP濃度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；理氣活血滴丸中、高劑量組及依那普利組大鼠BNP濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

3.2 理氣活血滴丸對(duì)CHF大鼠左心室功能的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠左心室收縮壓(LVSP)及左心室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)顯著降低，左心室舒張末壓(LVEDP )極顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，理氣活血滴丸低劑量組與模型組相比大鼠LVSP、LVEDP、左心室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；理氣活血滴丸中、高劑量和依那普利組大鼠LVSP和±dp/dtmax顯著升高，LVEDP顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清BNP水平、左心室功能指標(biāo)及心肌細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 理氣活血滴丸對(duì)CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果如圖1所示：對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性染色很少；模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性染色明顯增多；理氣活血滴丸低劑量組與模型組比較，大鼠心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性染色變化不明顯；理氣活血滴丸中、高劑量組和依那普利組大鼠心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性染色明顯減少。經(jīng)統(tǒng)計(jì)各組心肌細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)表1：模型組大鼠與對(duì)照組比較心肌細(xì)胞凋亡率顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)，理氣活血滴丸中、高劑量組和依那普利組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

4 討論

心力衰竭是許多發(fā)展中的心臟病的最后階段，是心臟病導(dǎo)致死亡的主要原因。在心力衰竭過(guò)程中，心肌細(xì)胞凋亡可降低心肌收縮力，從而促進(jìn)心力衰竭[11-12]。本研究理氣活血滴丸對(duì)心力衰竭大鼠左心室功能的改善作用及抑制心肌細(xì)胞凋亡作用。

臨床上，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)可直接反映心室舒張功能。LVSP是以等容收縮期結(jié)束時(shí)的左心室收縮壓為基礎(chǔ)，增強(qiáng)心室收縮或增加外周阻力，將導(dǎo)致LVSP增加；而LVEDP則是以等容收縮期結(jié)束時(shí)的左心室舒張壓為基礎(chǔ)的[13]。±dp/dtmax能反映心室壁張力的變化率，顯示心肌纖維收縮和延長(zhǎng)的最大速度[14]，所有這些都是常用的評(píng)價(jià)心肌收縮和舒張功能的特征[13]。BNP是一種重要的利鈉肽，是臨床心力衰竭的生物標(biāo)志物。心力衰竭時(shí)血流動(dòng)力學(xué)改變。由于血容量和心室壁張力的增加，心臟負(fù)荷聚集，因此，大部分儲(chǔ)存在心室肌中的合成的proBNP被釋放。Serine蛋白酶激活proBNP，產(chǎn)生活化的BNP。BNP的增加可反映左心室舒張末期壓力的增加。在心力衰竭過(guò)程中，血清中的BNP濃度隨著心力衰竭程度的增加而增加[15-16]。本研究表明理氣活血滴丸能使慢性心力衰竭大鼠左心室收縮壓( LVSP)、左心室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)顯著升高，左心室舒張末壓(LVEDP)顯著降低和血清BNP水平顯著降低，說(shuō)明理氣活血滴丸能明顯改善慢性心力衰竭大鼠左心室功能。

CHF的發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，目前還沒(méi)有一個(gè)明確的發(fā)病機(jī)制[17]。但是研究表明，心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，理氣活血滴丸能顯著降低心肌細(xì)胞TUNEL染色的陽(yáng)性率，提示理氣活血滴丸對(duì)ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠左心室功能的改善作用，與其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)而使理氣活血滴丸對(duì)大鼠慢性心力衰竭發(fā)揮保護(hù)作用。以往研究表明細(xì)胞凋亡主要有兩種途徑：外源性或死亡受體途徑和內(nèi)在或線粒體途徑[18-19]，下一步課題組將對(duì)此展開(kāi)深入研究。

綜上所述，理氣活血滴丸對(duì)ISO誘導(dǎo)的慢性心力衰竭大鼠具有保護(hù)作用，該保護(hù)作用與其能顯著改善CHF大鼠左心室功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。