王瑩瑩，李廣閱,2，徐巨龍，孫詩(shī)晴，薛超彬

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；2.山東鼎益生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，山東 臨沂 276000)

近年來(lái)，隨著氯蟲(chóng)苯甲酰胺和氟苯蟲(chóng)酰胺等雙酰胺類殺蟲(chóng)劑的大量使用，小菜蛾對(duì)該類藥劑的抗性問(wèn)題也變得十分突出，尤其是在亞熱帶地區(qū)更為嚴(yán)重[1]。在菲律賓、泰國(guó)和中國(guó)的南方較早發(fā)現(xiàn)了高抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺小菜蛾田間種群[2，3]，與敏感品系/種群相比，采自泰國(guó)的田間抗性種群具有超過(guò)200倍的抗性[2]；廣東增城的抗性種群具有2 140倍的抗性[3]；菲律賓的種群(Sudlon)具有超過(guò)4 100倍的抗性[2]，近期的研究表明該Sudlon種群對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的抗性倍數(shù)高達(dá)10 000[1]；在巴西發(fā)現(xiàn)了對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺具有22 793倍的田間抗性種群[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)和菲律賓的小菜蛾田間高抗種群中魚(yú)尼丁受體基因(PxRyR)的4 946位點(diǎn)均存在一個(gè)甘氨酸(G)到谷氨酸(E)的突變[2，5]，被認(rèn)為是導(dǎo)致小菜蛾對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺產(chǎn)生抗性的主要原因。本課題組在廣東增城地區(qū)的田間高抗小菜蛾種群中也發(fā)現(xiàn)了該突變位點(diǎn)，位于受體基因羧基末端的跨膜區(qū)附近，且在所有昆蟲(chóng)魚(yú)尼丁受體中高度保守[6]。同時(shí)，我們對(duì)不同抗性品系/種群小菜蛾進(jìn)行了抗性頻率檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)增城地區(qū)的抗性基因突變頻率高達(dá)90%以上[7]。此外，解毒酶活性的提高，如細(xì)胞色素P450單加氧酶(P450)、羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的提高[8，9]，PxRyR基因中4個(gè)位點(diǎn)的協(xié)同突變[10]以及PxRyR基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化等[7，11，12]，也是小菜蛾對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制，可見(jiàn)，小菜蛾對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺產(chǎn)生抗性的機(jī)制多樣且較為復(fù)雜。

本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)之上，利用小菜蛾敏感品系cDNA作為“驅(qū)動(dòng)子”來(lái)源，小菜蛾抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺品系、抗氟苯蟲(chóng)酰胺品系的cDNA分別作為“檢測(cè)子”來(lái)源，采用改進(jìn)的cDNA代表性差異分析法(cDNA RDA)，篩選小菜蛾抗藥性品系和敏感品系間的差異性表達(dá)基因，為鎖定抗性靶標(biāo)基因，進(jìn)一步揭示小菜蛾的抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小菜蛾敏感品系(S)于2006年采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)實(shí)驗(yàn)站園，在室內(nèi)不接觸任何藥劑，用小白菜苗長(zhǎng)期飼養(yǎng)且穩(wěn)定繁殖；抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺品系(Rf)和抗氟苯蟲(chóng)酰胺品系(Rh)是小菜蛾S品系分別在氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺藥劑的持續(xù)選擇壓力下篩選獲得的抗性品系，抗性倍數(shù)分別為684.54和677.25倍[13]。

1.2 RNA提取

分別選取抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺品系(Rf)、抗氟苯蟲(chóng)酰胺品系(Rh)和敏感品系(S)小菜蛾的4齡幼蟲(chóng)，迅速用液氮冷凍，用RNAiso Plus試劑盒(寶生物大連工程有限公司)提取RNA，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用PolyATtract?mRNA 純化系統(tǒng) Ⅲ (Promega，Madison，美國(guó))進(jìn)行小菜蛾mRNA的純化。

1.3 小菜蛾雙鏈cDNA的合成

采用RTAid Prem DS cDNA Synth Kit10 rxn (賽默飛世爾科技，北京)進(jìn)行小菜蛾雙鏈cDNA的合成。其中采用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提雙鏈cDNA，在30 μL 10 mol/L乙酸銨和250 μL乙醇中沉淀，然后-20℃過(guò)夜。4℃、14 000 r/min離心15 min，將得到的沉淀用70%乙醇洗滌2次，并風(fēng)干。-20℃保存在ddH2O中備用。

1.4 檢測(cè)子(Testers)和驅(qū)動(dòng)子(Drivers)制備

本試驗(yàn)采用的代表性差異分析法(RDA)參考Hubank和Schatz[14]介紹的方法。其中接頭和引物選用了3對(duì)接頭(由上海生工生物工程有限公司合成)，每對(duì)接頭均為24個(gè)堿基及12個(gè)堿基的寡核苷酸序列，其中的24個(gè)堿基作相應(yīng)的引物?！癛”接頭用于制備擴(kuò)增子，“J”及“N”接頭用于雜交擴(kuò)增反應(yīng)，所用引物如表1所示。

取獲得的cDNA樣品2 μg經(jīng)DpnⅡ(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)消化酶切處理，將酶切消化產(chǎn)物連接R24/R12接頭，16℃過(guò)夜。為了獲得足夠的下游所需擴(kuò)增子，PCR反應(yīng)采用22個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。擴(kuò)增前先于72℃孵育3 min，隨后加入Taq聚合酶，進(jìn)行22個(gè)循環(huán)：95℃ 1 min，72℃ 3 min，72℃延伸10 min。經(jīng)凝膠電泳證實(shí)每個(gè)擴(kuò)增子的大小。用DpnⅡ消化去除擴(kuò)增子的R24引物，作為下游反應(yīng)的切割驅(qū)動(dòng)子。在J12引物的作用下，將J24引物連接到切割驅(qū)動(dòng)子中，即可作為第一輪雜交的檢測(cè)子。

表1 cDNA代表性差異分析的接頭和引物

1.5 消減雜交與RDA差異片段的分離

第一輪雜交將50 ng J24連接的檢測(cè)子與4 μg驅(qū)動(dòng)子混合，將混合物用苯酚+氯仿+異戊醇(25∶24∶1)抽提，然后置于30 μL 10 mol/L乙酸銨和250 μL乙醇中，-70℃沉淀1 h。4℃、14 000 r/min離心15 min，所得沉淀用70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干。將所得沉淀溶于5 μL雜交緩沖液(30 mmol/L EPPS pH 8.0，30 mmol/L EDTA pH 8.0，ρ=0.1 g/mL PEG8000)中， 37℃溫育5 min，渦旋、離心。樣品用35 μL礦物油覆蓋，然后加熱至95℃ 3 min進(jìn)行變性，冷卻至67℃，并將1 μL 1 mol/L的NaCl加入到DNA中，之后，樣品在67℃中溫育20 h。孵育后去除礦物油，用TE(Tris-EDTA)進(jìn)行稀釋，在下游PCR反應(yīng)中使用5 μL雜交產(chǎn)物。雜交產(chǎn)物PCR擴(kuò)增前，先72℃孵育3 min，加入Taq聚合酶。隨后72℃ 5 min，加入引物(根據(jù)雜交輪次選用不同引物)。擴(kuò)增條件：95℃ 1 min，然后70℃ 3 min(J24)，共25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。為了將所得擴(kuò)增產(chǎn)物用綠豆芽核酸酶(寶生物大連工程有限公司)消化，消除單鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物，本試驗(yàn)采用改進(jìn)的PCR反應(yīng)，即在7個(gè)循環(huán)后從PCR反應(yīng)中取出10 μL試樣，將其置于同樣PCR反應(yīng)條件中進(jìn)行額外20個(gè)循環(huán)。按上述條件進(jìn)行第二輪和第三輪的雜交和擴(kuò)增，共進(jìn)行三輪，至少兩次重復(fù)，每輪反應(yīng)中“驅(qū)動(dòng)子”用量均為4 μg，檢測(cè)子與驅(qū)動(dòng)子的比例從第一輪的1∶100提高到第二輪的1∶800，直至第三輪的1∶20 000，其采用的接頭引物分別為N24/N12和J24/J12。最終獲得的基因片段在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)清晰條帶，并進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA RDA 差異片段的獲得

小菜蛾S品系、Rf和Rh抗性品系的cDNA經(jīng)DpnⅡ酶切后，在T4連接酶的作用下兩端連上R接頭，經(jīng)PCR擴(kuò)增，制備得到驅(qū)動(dòng)子和檢測(cè)子，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到200～750 bp的片段(圖1)。分析三輪消減雜交片段，發(fā)現(xiàn)第一輪雜交產(chǎn)物背景較高并有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明除了選擇性擴(kuò)增之外仍有大量的相同基因未能被消減。隨著消減雜交次數(shù)的增加，所獲得的差異性片段逐漸減少，在第二輪雜交后出現(xiàn)明顯的差異條帶，第三輪消減雜交之后，主要差異條帶得到了進(jìn)一步的增強(qiáng)，大約在150～200 bp之間(圖2)。

M為DNA Marker 2000；A為敏感品系；B為抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺抗性品系；C為抗氟蟲(chóng)雙酰胺抗性品系。

2.2 差異性片段的序列分析

將差異擴(kuò)增片段克隆于pSIMPLE-18 vector(TaKaRa)載體上，轉(zhuǎn)入菌株、氨芐篩選，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取12個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序，將所得序列分別用NCBI BLAST 進(jìn)行同源性比較。

小菜蛾抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺品系獲得9個(gè)cDNA RDA序列，其中有2條與28S rRNA基因有較高同源性，分別命名為DP3-1和DP3-2，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有1個(gè)序列與已知任何序列無(wú)同源性，命名為DP3-3，可能為未知基因，其它序列均為重復(fù)序列。小菜蛾抗氟苯蟲(chóng)酰胺品系獲得10個(gè)序列，其中有2個(gè)序列為DP3-1和DP3-2，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)1個(gè)未知序列，但不同于DP3-3，命名為DP3-4(表2)。

M為DNA Marker 2000；1～3為抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺品系第一、二、三輪的雜交產(chǎn)物；4～6為抗氟苯蟲(chóng)酰胺品系第一、二、三輪的雜交產(chǎn)物。

表2 cDNA RDA 獲得的差異性片段序列

2.3 差異性片段的同源性比較

DP3-1經(jīng)NCBI BLAST同源性比較，其與家蠶28S rRNA的同源性為98%，與棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞色素P450類TBP蛋白基因同源性為97%(表3)。研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)P450基因與昆蟲(chóng)的抗藥性相關(guān)，主要表現(xiàn)為該基因的表達(dá)量上調(diào)，并表現(xiàn)出較高的P450活性。DP3-2經(jīng)NCBI BLAST同源性比較，其與家蠶28S rRNA基因同源性為99%，與赤擬谷盜的TcasGA2_TC010626蛋白基因同源性為93%(表3)，但該蛋白的功能目前尚不明確。

表3 cDNA RDA 獲得的差異性片段的同源性比較

注：a、b分別代表序列在Rf和Rh抗性品系中RDA克隆的數(shù)目。

3 討論

cDNA RDA方法被廣泛應(yīng)用于小菜蛾差異性基因片段的研究中，李宗英等利用代表性差異分析技術(shù)在抗殺蟲(chóng)雙近等位基因中得到了2條差異片段(150～300 bp)，初步確認(rèn)為2個(gè)新序列[15]；張曉飛等采用代表性差異分析方法，研究了敏感品系和抗殺蟲(chóng)雙近等基因系，得到了2個(gè)差異片段[16]；王淑珍用cDNA 代表性差異分析技術(shù)從小菜蛾殺蟲(chóng)雙抗性品系和敏感品系中得到了一個(gè)差異性片段(100～200 bp)，該基因片段與28S rRNA基因有較高的同源性[17]；劉白朵等通過(guò)雙向cDNA RDA方法，從溴氰菊酯抗性品系小菜蛾和敏感品系小菜蛾中發(fā)現(xiàn)了一條序列與編碼S3a蛋白的基因有較高的同源性[18]。由此可見(jiàn)，cDNA RDA方法在小菜蛾抗藥性基因的篩選中發(fā)揮了重要的作用。

在消減雜交試驗(yàn)中，抑制性消減雜交(SSH) 和cDNA代表性差異性分析(cDNA RDA)是目前應(yīng)用最廣泛的方法，但是SSH更適合構(gòu)建差異基因文庫(kù)，因?yàn)樵摲椒▋H兩輪雜交，當(dāng)兩個(gè)樣本間的差異較小時(shí)假陽(yáng)性率高，SSH中兩次驅(qū)動(dòng)子 cDNA使用量均過(guò)量，可能會(huì)掩蓋檢測(cè)子cDNA中某些有表達(dá)差別的基因，因此，有些差異表達(dá)的基因可能檢測(cè)不到。本試驗(yàn)中兩個(gè)樣本之間遺傳背景相同，差異性較小，所以更適合用cDNA 代表性差異分析方法。

本研究利用cDNA 代表性差異分析技術(shù)從抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺和抗氟苯蟲(chóng)酰胺抗性品系中篩選出了2個(gè)差異基因片段DP3-1和DP3-2，同時(shí)得到了2個(gè)未知序列，DP3-1與棉鈴蟲(chóng)的細(xì)胞色素P450類TBP蛋白基因有97%的同源性。在已報(bào)道消減雜交的試驗(yàn)中都得到了細(xì)胞色素P450類TBP蛋白，何鵬通過(guò)抑制性消減雜交方法在低鹽脅迫下的橡膠樹(shù)中得到了細(xì)胞色素P450類TBP蛋白基因[19]；張建清通過(guò)抑制性消減雜交的方法從球孢白僵菌侵染昆蟲(chóng)和附著胞形成時(shí)期受BbMPK1 MAPK調(diào)控的下游基因分離得到了煙草細(xì)胞色素蛋白(cytochrome P450 like TBP)[20]；李玲等在桃花芽休眠解除SSH差減文庫(kù)中得到了紅花煙草細(xì)胞色素 P450類TBP[21]。研究表明，昆蟲(chóng)的細(xì)胞色素P450與殺蟲(chóng)劑的抗藥性有關(guān)，細(xì)胞色素P450酶系是與代謝抗性相關(guān)的主要解毒酶系之一，其抗藥性原理主要是由解毒作用的增強(qiáng)而導(dǎo)致的，表現(xiàn)為相應(yīng)的P450酶活性提高或其表達(dá)量的增強(qiáng)。本研究為后續(xù)深入研究小菜蛾對(duì)雙酰胺類殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制提供了新線索。