徐麗，陳新，張力思，魏海蓉，劉慶忠

(山東省果樹研究所/山東省果樹生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000)

低溫是限制植物分布與生長的重要環(huán)境因素之一，低溫凍害是全球農(nóng)林業(yè)普遍存在的自然災(zāi)害，給全世界農(nóng)林業(yè)造成了巨大損失，全球每年因低溫傷害造成的農(nóng)作物損失高達(dá)數(shù)千億美元，已引起各國政府和學(xué)者的普遍關(guān)注[1]。在植物響應(yīng)低溫脅迫的馴化過程中，體內(nèi)發(fā)生著許多生理生化和分子變化[2]，包括細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的變化、基因表達(dá)水平的變化等[3]。

1970年Weiser[4]提出植物在適應(yīng)低溫的過程中基因表達(dá)發(fā)生改變的觀點(diǎn)。Guy等[5]研究發(fā)現(xiàn)緩慢持續(xù)的低溫脅迫能誘導(dǎo)和增強(qiáng)一些基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物耐寒性，這種現(xiàn)象稱為低溫冷馴化，這種由冷脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)的基因稱為冷誘導(dǎo)基因(cold regulated gene，COR)。這類基因所表達(dá)的蛋白稱為低溫誘導(dǎo)蛋白。冷誘導(dǎo)基因編碼的產(chǎn)物可以分為兩類，一類是調(diào)控性蛋白，調(diào)控寒冷信號傳導(dǎo)、抗寒基因表達(dá)和抗寒蛋白活性；另一類是與植物抗寒性提高直接相關(guān)的功能性蛋白，比如一些涉及脂類代謝、糖代謝以及抗氧化的酶、分子伴侶、抗凍蛋白和其它起滲透調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)[6]。

脫水素(dehydrins，DHNs)屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA)，是一種親水性蛋白，屬于LEA蛋白的第二家族[7]。脫水素顯著的特征是在C端或其附近含有至少一個富含賴氨酸的基序，由約15個氨基酸殘基(EKKGIMDKIKEKLPG)組成的K片段，此片段在不同物種間極為保守；N端含有保守基序T/VDEYGNP組成的Y片段，K片段與Y片段之間有可被磷酸化的約6個絲氨酸串聯(lián)成的S片段。所有的脫水素不一定含有Y和S片段，但都含有K片段，它是第二組LEA區(qū)別于其它組的特征[8,9]。低溫是限制植物生長和影響產(chǎn)量的主要非生物逆境之一，脫水素在抵御低溫等非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[10]。有研究表明過量表達(dá)脫水素基因可增強(qiáng)擬南芥的低溫抗性，提高抗寒力[11]；Kosová等[12]發(fā)現(xiàn)低溫鍛煉后，10個大麥品種中Dhn5基因的積累量與其抵御凍害的能力呈正相關(guān)；小麥脫水素WCS120的積累量與其獲得的冰凍抗性呈正相關(guān)，可以區(qū)分不同冬小麥品種的冰凍抗性強(qiáng)弱[13,14]；酒紅杜鵑和云錦杜鵑雜交后代葉片中脫水素基因的表達(dá)與其抗凍能力密切相關(guān)[15]。

核桃(Juglansregia)又名胡桃、羌桃、波斯胡桃或英國胡桃，是胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)的一種植物。核桃作為我國具有很高經(jīng)濟(jì)價值的經(jīng)濟(jì)林樹種，在北方地區(qū)的氣候中，冬春季經(jīng)常受到寒流和冷空氣的侵襲。低溫凍害是影響核桃生長發(fā)育以及造成其產(chǎn)量和質(zhì)量下降的主要脅迫因素之一，在寒害發(fā)生嚴(yán)重的年份，可以造成核桃大面積減產(chǎn)甚至地區(qū)性核桃絕收，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。而我國南方的核桃品種與北方核桃品種相比，抗寒性更差，因此將南方核桃品種引種到北方種植面臨嚴(yán)重的寒害問題，多數(shù)南方核桃品種因低溫侵害而凍死。因此對核桃進(jìn)行低溫、抗寒的研究在理論和實(shí)踐上都有重要意義。

本研究通過RACE技術(shù)克隆了與低溫脅迫相關(guān)的核桃脫水素基因JrCOR的全長序列，分析了該基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式,為將其進(jìn)一步應(yīng)用于核桃抗寒分子標(biāo)記輔助育種提供參考依據(jù)，為利用基因工程手段培育抗寒核桃新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料與處理 試驗(yàn)所用核桃材料取自于山東省果樹研究所國家核桃資源圃。

材料處理：(1)為研究在人工可控條件下JrCOR基因的表達(dá)，將山東省果樹生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的香玲核桃組培苗放入光照箱中適應(yīng)2 h以上(光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1，光照時間16 h/8 h，晝夜溫度25℃/21℃，濕度80%～90%)，然后進(jìn)行4℃低溫脅迫處理，分別在處理0、2、4、8、24 h后采集葉位相同的葉片，用于研究JrCOR基因響應(yīng)低溫的表達(dá)模式。(2)參照Naik等[16]的方法(稍作修改)，分別于2014年11月15日(處于未進(jìn)入冷適應(yīng)時期，NC，non-cold acclimation，日均溫7℃以上)、2014年12月6日(處于冷適應(yīng)時期，CA，cold acclimation，日均溫7℃以下)、2015年1月6日(處于中冬時期，MW，mid-winter，日均溫0℃以下)、2015年3月6日(處于脫除冷適應(yīng)時期，DA，deacclimation，日均溫回升至7℃以上)四個時期摘取花芽，用于研究JrCOR基因的季節(jié)表達(dá)。

1.1.2 試劑 EASYspin植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司,TaqDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒和DNaseⅠ等均購自天根公司，PCR試劑及克隆載體pMD19-T Vector均購于寶生物(大連)有限公司,熒光定量PCR試劑用品購自康為世紀(jì)公司。

1.1.3 儀器和設(shè)備 Eppendorf移液器，Eppendorf臺式離心機(jī)，漩渦振蕩器，金屬浴儀，電子天平，超純水儀，PCR儀，微波爐，真空抽氣泵，酸度計(jì)，電泳儀，超凈工作臺，恒溫?fù)u床，凝膠成像儀，紫外分析儀，熒光定量PCR儀，高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.1.4 PCR引物 根據(jù)GenBank中登錄的脫水素蛋白保守區(qū)序列，通過DNAMAN比對人工設(shè)計(jì)簡并引物，采用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)特異引物，以18SrDNA為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 引物信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1JrCOR基因的克隆 使用EASYspin植物RNA提取試劑盒及RNase-Free DnaseⅠ純化。利用Thermo Scientific公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以O(shè)ligo(dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。利用簡并引物P1和P2(表1)進(jìn)行中間片段的擴(kuò)增。根據(jù)已知中間片段，設(shè)計(jì)引物P3和P4(表1)進(jìn)行基因3′端和5′端片段擴(kuò)增。然后根據(jù)所得的序列，設(shè)計(jì)引物P5和P6(表1)進(jìn)行基因ORF擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和DNAMAN分析JrCOR核苷酸和氨基酸序列，進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的相對分子量、理論等電點(diǎn)、親水性、不穩(wěn)定指數(shù)Ⅱ等。

1.2.3JrCOR表達(dá)模式分析 分別提取不同季節(jié)、不同組織和低溫脅迫處理不同時間的核桃材料總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈作為實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)的模板。以核桃18SrDNA基因?yàn)閮?nèi)參，以獲得的JrCOR基因全長序列為模板設(shè)計(jì)一對引物P7和P8(表1)，進(jìn)行熒光定量分析。每個試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，利用ABI 7500 PCR儀Sequence Detection Software(2-ΔΔCt法)和Origin 6.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 JrCOR基因的克隆

以核桃cDNA為模板，用簡并引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了中間片段約626 bp。通過RACE-PCR獲得了5′端片段758 bp和3′端片段514 bp，分別與目的基因的5′端和3′端片段大小相符，且均與中間片段重疊。根據(jù)所獲得的中間片段、5′端片段和3′端片段拼接出基因全長序列，設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得目的片段(圖1)。利用NCBI ORF Finder可知，該基因全長1 156 bp，5′UTR為176 bp，3′UTR 239 bp，ORF為741 bp，編碼246個氨基酸。具有一個明顯的S區(qū)域特征位點(diǎn)和兩個K區(qū)域特征位點(diǎn)，因此屬于LEA蛋白的第二家族SK2類型[10](圖2)。

2.2 生物信息學(xué)分析

通過在線軟件Protparam預(yù)測，蛋白質(zhì)的分子式為C1241H1969N337O426S2，分子量為58.1 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為5.28，總體親水性(GRAVY)為-1.673，屬于親水蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)Ⅱ?yàn)?1.53，屬于不穩(wěn)定蛋白。選擇同源性較高的幾個物種進(jìn)行進(jìn)化樹比對，如圖3所示，同屬的葡萄柚和橙聚為一束，同屬于薔薇科的蘋果與枇杷聚為一束，核桃與中?？Х扔H緣關(guān)系較近，符合APG分類系統(tǒng)(圖3)。

A:中間片段；B：3′RACE片段；C：5′RACE片段；D：全長cDNA片段；M: DL2000 Maker。

氨基酸序列以單個字母表示。下劃線為轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG；星號標(biāo)記為終止密碼子TAA；方框部分表示S區(qū)域特征位點(diǎn)；陰影部分表示K區(qū)域特征位點(diǎn)。

橡膠樹Hevea brasiliensis (ANG59272.1.)；木薯Manihot esculenta(AGC51777.1)；棗Ziziphus jujube(XP_015884105.1)；木豆Cajanus cajan(XP_020216079.1)；中?？Х菴offea canephora(ABC68275.1)；遼楊Populus maximowiczii(ABS12346.1)；蘋果Malus domestica(NP_001315938.1)；葡萄柚Citrus paradise(AAN78125.1)；枇杷Eriobotrya japonica(AGV21054.1)；白羽扇豆Lupinus albus(AAT06600.2)；山茶Camellia sinensis(ACT10283.1)；白車軸草Trifolium repens(ADD09608.1)；橙Citrus sinensis(XP_006473752.1)；可可Theobroma cacao(EOY15190.1)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3 JrCOR基因不同時期的表達(dá)變化

通過熒光定量PCR對不同季節(jié)核桃花芽中JrCOR基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在自然越冬條件下，JrCOR基因的總體表達(dá)趨勢表現(xiàn)為隨著冬季氣溫的降低，JrCOR基因的表達(dá)量升高，而進(jìn)入春季氣溫回升后，JrCOR基因的表達(dá)量降低(圖4)。對前面兩個時間的對比可以發(fā)現(xiàn)，JrCOR基因的表達(dá)量會隨著氣溫的變化而有所波動；第三個取材時間是在小寒和大寒節(jié)氣之間，這個階段的氣溫很低，JrCOR基因的表達(dá)水平相對較高，以保證核桃的抗寒性足夠越冬；第四個取材時間是驚蟄節(jié)氣過后，氣溫已經(jīng)回升，JrCOR基因表達(dá)水平相應(yīng)降低，因此后面兩個時間點(diǎn)的JrCOR基因表達(dá)水平差異相對較大。

2.4 JrCOR 基因低溫脅迫條件下的表達(dá)變化

從低溫脅迫處理下JrCOR基因表達(dá)結(jié)果來看，經(jīng)4℃低溫處理不同時間后，JrCOR基因表達(dá)量不同，隨處理時間延長呈先升后降趨勢，這可能與該基因在冷脅迫過程中所行使的功能有關(guān)(圖5)。4℃處理2 h時，JrCOR基因表達(dá)量迅速增加，表明JrCOR基因受低溫誘導(dǎo)。隨后其表達(dá)量繼續(xù)升高，在處理4 h時表達(dá)量到達(dá)高峰。4℃處理8 h時JrCOR的表達(dá)降至較低水平，與未處理和處理24 h時的表達(dá)量接近。

圖4 不同時期核桃花芽中JrCOR基因的表達(dá)模式

圖5 核桃葉片JrCOR基因在低溫脅迫條件下的表達(dá)模式

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)選取核桃品種‘香玲’為研究對象，是因?yàn)橄懔崞焚|(zhì)優(yōu)良，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和推廣前景。通過同源克隆的方法獲得JrCOR基因全長序列，其具有明顯的S區(qū)和K區(qū)，屬于典型的SK2型脫水素基因。進(jìn)化分析結(jié)果也符合傳統(tǒng)分類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。在表達(dá)分析的研究中，熒光定量PCR結(jié)果表明越冬過程中JrCOR基因的表達(dá)水平存在變化，總體趨勢是冬季氣溫降低表達(dá)水平上升而進(jìn)入春季氣溫升高表達(dá)水平下降，可能是因?yàn)槠浔磉_(dá)與低溫誘導(dǎo)關(guān)系顯著，這與本課題組先前的研究結(jié)果相似[17]。

低溫脅迫處理的熒光定量PCR結(jié)果顯示，在模擬低溫環(huán)境下處理2 h時，JrCOR的表達(dá)水平迅速升高，4 h時達(dá)到最大值，說明核桃JrCOR基因受低溫脅迫的誘導(dǎo)，而且能快速響應(yīng)低溫脅迫，這種快速響應(yīng)低溫信號的結(jié)果和陳新[18]在榛子上的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)對核桃抗寒基因JrCOR進(jìn)行了初步研究，為增強(qiáng)核桃類植物的抗寒性和培育有較強(qiáng)抗寒能力的核桃品種提供了分子水平的理論依據(jù)。后續(xù)可繼續(xù)開展構(gòu)建表達(dá)載體，在核桃組織中超表達(dá)目的基因，以探究其過量表達(dá)對核桃某些性狀的影響，檢測核桃的抗寒性；另還可以對該基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行更細(xì)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及其功能相關(guān)方面的研究。