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        核桃JrCOR基因的克隆及表達(dá)分析

        2018-11-05 04:02:06徐麗陳新張力思魏海蓉劉慶忠
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年10期
        關(guān)鍵詞:抗寒核桃低溫

        徐麗,陳新,張力思,魏海蓉,劉慶忠

        (山東省果樹(shù)研究所/山東省果樹(shù)生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安 271000)

        低溫是限制植物分布與生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素之一,低溫凍害是全球農(nóng)林業(yè)普遍存在的自然災(zāi)害,給全世界農(nóng)林業(yè)造成了巨大損失,全球每年因低溫傷害造成的農(nóng)作物損失高達(dá)數(shù)千億美元,已引起各國(guó)政府和學(xué)者的普遍關(guān)注[1]。在植物響應(yīng)低溫脅迫的馴化過(guò)程中,體內(nèi)發(fā)生著許多生理生化和分子變化[2],包括細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的變化、基因表達(dá)水平的變化等[3]。

        1970年Weiser[4]提出植物在適應(yīng)低溫的過(guò)程中基因表達(dá)發(fā)生改變的觀點(diǎn)。Guy等[5]研究發(fā)現(xiàn)緩慢持續(xù)的低溫脅迫能誘導(dǎo)和增強(qiáng)一些基因的表達(dá),增強(qiáng)植物耐寒性,這種現(xiàn)象稱為低溫冷馴化,這種由冷脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)的基因稱為冷誘導(dǎo)基因(cold regulated gene,COR)。這類基因所表達(dá)的蛋白稱為低溫誘導(dǎo)蛋白。冷誘導(dǎo)基因編碼的產(chǎn)物可以分為兩類,一類是調(diào)控性蛋白,調(diào)控寒冷信號(hào)傳導(dǎo)、抗寒基因表達(dá)和抗寒蛋白活性;另一類是與植物抗寒性提高直接相關(guān)的功能性蛋白,比如一些涉及脂類代謝、糖代謝以及抗氧化的酶、分子伴侶、抗凍蛋白和其它起滲透調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)[6]。

        脫水素(dehydrins,DHNs)屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA),是一種親水性蛋白,屬于LEA蛋白的第二家族[7]。脫水素顯著的特征是在C端或其附近含有至少一個(gè)富含賴氨酸的基序,由約15個(gè)氨基酸殘基(EKKGIMDKIKEKLPG)組成的K片段,此片段在不同物種間極為保守;N端含有保守基序T/VDEYGNP組成的Y片段,K片段與Y片段之間有可被磷酸化的約6個(gè)絲氨酸串聯(lián)成的S片段。所有的脫水素不一定含有Y和S片段,但都含有K片段,它是第二組LEA區(qū)別于其它組的特征[8,9]。低溫是限制植物生長(zhǎng)和影響產(chǎn)量的主要非生物逆境之一,脫水素在抵御低溫等非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[10]。有研究表明過(guò)量表達(dá)脫水素基因可增強(qiáng)擬南芥的低溫抗性,提高抗寒力[11];Kosová等[12]發(fā)現(xiàn)低溫鍛煉后,10個(gè)大麥品種中Dhn5基因的積累量與其抵御凍害的能力呈正相關(guān);小麥脫水素WCS120的積累量與其獲得的冰凍抗性呈正相關(guān),可以區(qū)分不同冬小麥品種的冰凍抗性強(qiáng)弱[13,14];酒紅杜鵑和云錦杜鵑雜交后代葉片中脫水素基因的表達(dá)與其抗凍能力密切相關(guān)[15]。

        核桃(Juglansregia)又名胡桃、羌桃、波斯胡桃或英國(guó)胡桃,是胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)的一種植物。核桃作為我國(guó)具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種,在北方地區(qū)的氣候中,冬春季經(jīng)常受到寒流和冷空氣的侵襲。低溫凍害是影響核桃生長(zhǎng)發(fā)育以及造成其產(chǎn)量和質(zhì)量下降的主要脅迫因素之一,在寒害發(fā)生嚴(yán)重的年份,可以造成核桃大面積減產(chǎn)甚至地區(qū)性核桃絕收,導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。而我國(guó)南方的核桃品種與北方核桃品種相比,抗寒性更差,因此將南方核桃品種引種到北方種植面臨嚴(yán)重的寒害問(wèn)題,多數(shù)南方核桃品種因低溫侵害而凍死。因此對(duì)核桃進(jìn)行低溫、抗寒的研究在理論和實(shí)踐上都有重要意義。

        本研究通過(guò)RACE技術(shù)克隆了與低溫脅迫相關(guān)的核桃脫水素基因JrCOR的全長(zhǎng)序列,分析了該基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式,為將其進(jìn)一步應(yīng)用于核桃抗寒分子標(biāo)記輔助育種提供參考依據(jù),為利用基因工程手段培育抗寒核桃新品種奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 植物材料與處理 試驗(yàn)所用核桃材料取自于山東省果樹(shù)研究所國(guó)家核桃資源圃。

        材料處理:(1)為研究在人工可控條件下JrCOR基因的表達(dá),將山東省果樹(shù)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的香玲核桃組培苗放入光照箱中適應(yīng)2 h以上(光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1,光照時(shí)間16 h/8 h,晝夜溫度25℃/21℃,濕度80%~90%),然后進(jìn)行4℃低溫脅迫處理,分別在處理0、2、4、8、24 h后采集葉位相同的葉片,用于研究JrCOR基因響應(yīng)低溫的表達(dá)模式。(2)參照Naik等[16]的方法(稍作修改),分別于2014年11月15日(處于未進(jìn)入冷適應(yīng)時(shí)期,NC,non-cold acclimation,日均溫7℃以上)、2014年12月6日(處于冷適應(yīng)時(shí)期,CA,cold acclimation,日均溫7℃以下)、2015年1月6日(處于中冬時(shí)期,MW,mid-winter,日均溫0℃以下)、2015年3月6日(處于脫除冷適應(yīng)時(shí)期,DA,deacclimation,日均溫回升至7℃以上)四個(gè)時(shí)期摘取花芽,用于研究JrCOR基因的季節(jié)表達(dá)。

        1.1.2 試劑 EASYspin植物RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司,TaqDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒和DNaseⅠ等均購(gòu)自天根公司,PCR試劑及克隆載體pMD19-T Vector均購(gòu)于寶生物(大連)有限公司,熒光定量PCR試劑用品購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

        1.1.3 儀器和設(shè)備 Eppendorf移液器,Eppendorf臺(tái)式離心機(jī),漩渦振蕩器,金屬浴儀,電子天平,超純水儀,PCR儀,微波爐,真空抽氣泵,酸度計(jì),電泳儀,超凈工作臺(tái),恒溫?fù)u床,凝膠成像儀,紫外分析儀,熒光定量PCR儀,高壓蒸汽滅菌鍋等。

        1.1.4 PCR引物 根據(jù)GenBank中登錄的脫水素蛋白保守區(qū)序列,通過(guò)DNAMAN比對(duì)人工設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,采用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)特異引物,以18SrDNA為內(nèi)參基因。引物序列見(jiàn)表1。

        表1 引物信息

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1JrCOR基因的克隆 使用EASYspin植物RNA提取試劑盒及RNase-Free DnaseⅠ純化。利用Thermo Scientific公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,以O(shè)ligo(dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。利用簡(jiǎn)并引物P1和P2(表1)進(jìn)行中間片段的擴(kuò)增。根據(jù)已知中間片段,設(shè)計(jì)引物P3和P4(表1)進(jìn)行基因3′端和5′端片段擴(kuò)增。然后根據(jù)所得的序列,設(shè)計(jì)引物P5和P6(表1)進(jìn)行基因ORF擴(kuò)增驗(yàn)證。

        1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和DNAMAN分析JrCOR核苷酸和氨基酸序列,進(jìn)行同源性分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、親水性、不穩(wěn)定指數(shù)Ⅱ等。

        1.2.3JrCOR表達(dá)模式分析 分別提取不同季節(jié)、不同組織和低溫脅迫處理不同時(shí)間的核桃材料總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的模板。以核桃18SrDNA基因?yàn)閮?nèi)參,以獲得的JrCOR基因全長(zhǎng)序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物P7和P8(表1),進(jìn)行熒光定量分析。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),利用ABI 7500 PCR儀Sequence Detection Software(2-ΔΔCt法)和Origin 6.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 JrCOR基因的克隆

        以核桃cDNA為模板,用簡(jiǎn)并引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了中間片段約626 bp。通過(guò)RACE-PCR獲得了5′端片段758 bp和3′端片段514 bp,分別與目的基因的5′端和3′端片段大小相符,且均與中間片段重疊。根據(jù)所獲得的中間片段、5′端片段和3′端片段拼接出基因全長(zhǎng)序列,設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得目的片段(圖1)。利用NCBI ORF Finder可知,該基因全長(zhǎng)1 156 bp,5′UTR為176 bp,3′UTR 239 bp,ORF為741 bp,編碼246個(gè)氨基酸。具有一個(gè)明顯的S區(qū)域特征位點(diǎn)和兩個(gè)K區(qū)域特征位點(diǎn),因此屬于LEA蛋白的第二家族SK2類型[10](圖2)。

        2.2 生物信息學(xué)分析

        通過(guò)在線軟件Protparam預(yù)測(cè),蛋白質(zhì)的分子式為C1241H1969N337O426S2,分子量為58.1 ku,理論等電點(diǎn)(pI)為5.28,總體親水性(GRAVY)為-1.673,屬于親水蛋白,不穩(wěn)定指數(shù)Ⅱ?yàn)?1.53,屬于不穩(wěn)定蛋白。選擇同源性較高的幾個(gè)物種進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)比對(duì),如圖3所示,同屬的葡萄柚和橙聚為一束,同屬于薔薇科的蘋果與枇杷聚為一束,核桃與中??Х扔H緣關(guān)系較近,符合APG分類系統(tǒng)(圖3)。

        A:中間片段;B:3′RACE片段;C:5′RACE片段;D:全長(zhǎng)cDNA片段;M: DL2000 Maker。

        氨基酸序列以單個(gè)字母表示。下劃線為轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG;星號(hào)標(biāo)記為終止密碼子TAA;方框部分表示S區(qū)域特征位點(diǎn);陰影部分表示K區(qū)域特征位點(diǎn)。

        橡膠樹(shù)Hevea brasiliensis (ANG59272.1.);木薯Manihot esculenta(AGC51777.1);棗Ziziphus jujube(XP_015884105.1);木豆Cajanus cajan(XP_020216079.1);中??Х菴offea canephora(ABC68275.1);遼楊Populus maximowiczii(ABS12346.1);蘋果Malus domestica(NP_001315938.1);葡萄柚Citrus paradise(AAN78125.1);枇杷Eriobotrya japonica(AGV21054.1);白羽扇豆Lupinus albus(AAT06600.2);山茶Camellia sinensis(ACT10283.1);白車軸草Trifolium repens(ADD09608.1);橙Citrus sinensis(XP_006473752.1);可可Theobroma cacao(EOY15190.1)。

        系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

        2.3 JrCOR基因不同時(shí)期的表達(dá)變化

        通過(guò)熒光定量PCR對(duì)不同季節(jié)核桃花芽中JrCOR基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在自然越冬條件下,JrCOR基因的總體表達(dá)趨勢(shì)表現(xiàn)為隨著冬季氣溫的降低,JrCOR基因的表達(dá)量升高,而進(jìn)入春季氣溫回升后,JrCOR基因的表達(dá)量降低(圖4)。對(duì)前面兩個(gè)時(shí)間的對(duì)比可以發(fā)現(xiàn),JrCOR基因的表達(dá)量會(huì)隨著氣溫的變化而有所波動(dòng);第三個(gè)取材時(shí)間是在小寒和大寒節(jié)氣之間,這個(gè)階段的氣溫很低,JrCOR基因的表達(dá)水平相對(duì)較高,以保證核桃的抗寒性足夠越冬;第四個(gè)取材時(shí)間是驚蟄節(jié)氣過(guò)后,氣溫已經(jīng)回升,JrCOR基因表達(dá)水平相應(yīng)降低,因此后面兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的JrCOR基因表達(dá)水平差異相對(duì)較大。

        2.4 JrCOR 基因低溫脅迫條件下的表達(dá)變化

        從低溫脅迫處理下JrCOR基因表達(dá)結(jié)果來(lái)看,經(jīng)4℃低溫處理不同時(shí)間后,JrCOR基因表達(dá)量不同,隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì),這可能與該基因在冷脅迫過(guò)程中所行使的功能有關(guān)(圖5)。4℃處理2 h時(shí),JrCOR基因表達(dá)量迅速增加,表明JrCOR基因受低溫誘導(dǎo)。隨后其表達(dá)量繼續(xù)升高,在處理4 h時(shí)表達(dá)量到達(dá)高峰。4℃處理8 h時(shí)JrCOR的表達(dá)降至較低水平,與未處理和處理24 h時(shí)的表達(dá)量接近。

        圖4 不同時(shí)期核桃花芽中JrCOR基因的表達(dá)模式

        圖5 核桃葉片JrCOR基因在低溫脅迫條件下的表達(dá)模式

        3 討論與結(jié)論

        本試驗(yàn)選取核桃品種‘香玲’為研究對(duì)象,是因?yàn)橄懔崞焚|(zhì)優(yōu)良,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和推廣前景。通過(guò)同源克隆的方法獲得JrCOR基因全長(zhǎng)序列,其具有明顯的S區(qū)和K區(qū),屬于典型的SK2型脫水素基因。進(jìn)化分析結(jié)果也符合傳統(tǒng)分類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。在表達(dá)分析的研究中,熒光定量PCR結(jié)果表明越冬過(guò)程中JrCOR基因的表達(dá)水平存在變化,總體趨勢(shì)是冬季氣溫降低表達(dá)水平上升而進(jìn)入春季氣溫升高表達(dá)水平下降,可能是因?yàn)槠浔磉_(dá)與低溫誘導(dǎo)關(guān)系顯著,這與本課題組先前的研究結(jié)果相似[17]。

        低溫脅迫處理的熒光定量PCR結(jié)果顯示,在模擬低溫環(huán)境下處理2 h時(shí),JrCOR的表達(dá)水平迅速升高,4 h時(shí)達(dá)到最大值,說(shuō)明核桃JrCOR基因受低溫脅迫的誘導(dǎo),而且能快速響應(yīng)低溫脅迫,這種快速響應(yīng)低溫信號(hào)的結(jié)果和陳新[18]在榛子上的研究結(jié)果一致。

        本試驗(yàn)對(duì)核桃抗寒基因JrCOR進(jìn)行了初步研究,為增強(qiáng)核桃類植物的抗寒性和培育有較強(qiáng)抗寒能力的核桃品種提供了分子水平的理論依據(jù)。后續(xù)可繼續(xù)開(kāi)展構(gòu)建表達(dá)載體,在核桃組織中超表達(dá)目的基因,以探究其過(guò)量表達(dá)對(duì)核桃某些性狀的影響,檢測(cè)核桃的抗寒性;另還可以對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行更細(xì)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及其功能相關(guān)方面的研究。

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