陳 玲，馬衛(wèi)，許 銀，倪 紅

(湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

1 引言

磷、氮元素都是植物生長不可缺少的元素，研究表明我國土壤中總磷含量較高，但是大部分的磷會(huì)和一些金屬離子結(jié)合成難溶性磷酸鹽而難以被植物吸收利用[1]。植物每年都會(huì)從土壤中吸收大量的氮元素，造成土壤中氮元素含量降低。一般通過施加化肥來提高土壤中氮、磷元素含量，但是長期過量的施加化肥會(huì)導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，光化學(xué)煙霧污染,土壤板結(jié)[2]等問題，造成了大量的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。而土壤中廣泛存在的一種細(xì)菌—溶磷細(xì)菌(phosphate solubilizing bacteria)，簡稱PSB，能夠通過自身代謝作用將土壤中的難溶性磷素(比如磷酸鈣、磷礦粉等)溶解[3,4]，使其轉(zhuǎn)化為易于被植物吸收利用的有效磷。PSB可以通過分泌有機(jī)酸結(jié)合金屬離子從而釋放磷酸根離子，或者通過分泌磷酸酶來降解有機(jī)磷從而增加土壤中磷含量[5,6]。利用溶磷菌增加土壤肥力對(duì)我國農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重大意義。陸瑞霞[7]等人通過溶磷圈法篩選出7株溶磷菌株，溶磷量在123.37～135.23 mg/L之間，都能分泌吲哚乙酸(簡稱IAA)；李顯剛[1]等人通過溶磷菌圈法在百脈根部篩選出11株溶磷菌，各菌株溶磷量在 94.35 ～ 400.49 mg/L 之，大部分具有分泌IAA的能力；李玉娥[8]等人對(duì)5株溶磷菌的溶磷特性和分泌 IAA 能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溶磷能力最強(qiáng)的溶磷量為300.3 mg/L，都有分泌 IAA 特性, 最大分泌量為 17.95 mg/L。本文從湖北某磷化工廠周邊的土樣中篩選到的一株高效溶磷菌MEC35，經(jīng)鑒定為檸檬酸桿菌Citrobacter sp.，在28 ℃，180 r/min的條件下對(duì)磷酸鎂、磷酸鈣和磷礦粉的最大溶解能力分別是872.6315 mg/L、701.1873 mg/L和291.2195 mg/L，是一株高效溶磷菌，目前較多報(bào)道許多溶磷菌能分泌IAA，但能分泌吲哚乙酸(IAA)同時(shí)能固氮的溶磷菌很少有報(bào)道。MEC35能增加土壤中的有效磷含量，還能通過固氮作用增加土壤中氮的含量，且能夠分泌IAA促進(jìn)植物生長，具有增加土壤肥效，促進(jìn)作物生長，增加坐果率等方面的應(yīng)用潛力。

2 材料和方法

2.1 供試土樣和試劑

供試土樣采集于湖北某磷化工廠周邊的土壤。所用的試劑：葡萄糖、酵母粉、甘露醇、蘋果酸、二水鉬酸鈉、生物素、維生素B6、H2BO3、溴百里酚藍(lán)以及其他常規(guī)試劑均為分析純，購于國藥化學(xué)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。磷礦粉為某磷化工廠的廢渣。

2.2 培養(yǎng)基的配置

難溶無機(jī)磷培養(yǎng)基(PKO培養(yǎng)基)：葡萄糖 10 g、酵母粉 0.5 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、磷酸鈣 5.0 g、蒸餾水 1000 mL，pH值7.0～7.5。

阿氏無氮培養(yǎng)基(Ashby)：甘露醇10 g，KH2PO40.2 g， MgSO4·7H2O 0.2 g， NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO35.0 g，蒸餾水定容至1 L。

無氮培養(yǎng)基( Nfb): 蘋果酸5 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，溴百里酚藍(lán) 2 mL，F(xiàn)e(3)-EDTA(1.64%) 4 mL，維生素溶液(VB6 200 mg/L，生物素 100 mg/L) 1 mL，微量元素(CuSO40.4 g/L，ZnSO40.12 g/L，H2BO31.4 g/L，二水鉬酸鈉 1 g/L，MnSO41.5 g/L) 2 mL。

Salkowski顯色液：50 mL 35 % HClO4+1 mL 0. 5 mol/L FeCl3

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 溶磷菌株的篩選

稱取10 g的土樣，添加到100 mL難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，在 28 ℃、180 r/min條件下，搖瓶培養(yǎng)2 d，然后涂布于難溶無機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上于 28 ℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，挑取溶磷圈較大的菌株，待鑒定[9]。

2.3.2 高效溶磷菌株的16S RNA鑒定

以篩選的菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)混合液：金牌Mix(green) 45 μL、10 μM的上下游引物各 2 μL：1492R( 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 和 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')、模板 1 μL，總體系為50 μL。涂布于含有1 μL/mL Amp的LB平板上37 ℃倒置培養(yǎng)10～16 h，挑取轉(zhuǎn)化子，送到武漢擎科生物科技公司測(cè)序。將測(cè)序得到的結(jié)果跟ezbiocloud細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，并利用N-J法，和MEGA 6.0軟件對(duì)該菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析和鑒定，將篩選鑒定的菌株命名為MEC35。

2.3.3 MEC35菌株對(duì)五種不同難溶性磷酸鹽溶解效果實(shí)驗(yàn)

將MEC35菌株活化過夜，按2%的接種量接種到含0.5%磷酸鈣的PKO培養(yǎng)基中，于28 ℃ ，180 r/min條件下培養(yǎng)。每隔0、4、8、12、18、24、30、36、48、60、72 h取4 mL樣品，于8000 rpm條件下離心 3 min，采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定(OD700)上清液中有效磷的濃度，以不加菌液的PKO培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。以上每個(gè)處理重復(fù)三次。

同理，將PKO培養(yǎng)基中的磷酸鈣分別換成相同濃度的磷酸鐵、磷酸鎂、磷酸鋁、磷礦粉，按照上述方法，可以分別測(cè)出MEC35對(duì)這些無機(jī)磷的溶解效果。

2.3.4 MEC35菌株分泌IAA能力的測(cè)定

2.3.4.1 MEC35菌株分泌IAA能力定性測(cè)定

將單菌落過夜活化，按2%的接種量接入到含100 mg/L色氨酸的LB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 rpm條件下培養(yǎng)24 h，取100 μL菌懸液滴在96孔板上，再分別取含100 μL的10、30、50 mg/L IAA的溶液，滴在96孔板上作為陽性對(duì)照，以未接菌含100 mg/L色氨酸的LB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。在上述樣品中分別100 μL的Salkowski顯色液，在室溫下避光 30 min，觀察其顏色變化，以確定菌株IAA分泌的強(qiáng)度[10]。以上每個(gè)處理重復(fù)二次。

2.3.4.2 MEC35菌株分泌IAA能力定量測(cè)定

IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制濃度為0～60 mg/L IAA梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，將IAA標(biāo)液和Salkowski顯色液等體積混合，室溫下避光30 min(蒸餾水和Salkowski顯色液等體積混合作為空白對(duì)照)，在530 nm下測(cè)定吸光值，以IAA濃度為橫坐標(biāo)，OD530為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

取5 mL在含100 mg/L色氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的菌懸液，在8000 r/min下離心5 min，取2 mL上清液等比例加Salkowski顯色液，混勻，室溫下避光30 min 后立即測(cè)定OD530，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計(jì)算發(fā)酵液中 IAA含量(mg/L)。以未接菌含100 mg/L色氨酸的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照。

2.3.5 MEC35菌株固氮能力測(cè)定

將MEC35菌液在NFB無氮培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)[12,13]，分別以大腸桿菌和固氮菌(購買于中國工業(yè)微生物保藏管理中心CICC)作為陰性陽性對(duì)照，將正常生長的菌株送南京卡文斯生物技術(shù)有限公司測(cè)定其固氮能力。

將過夜活化的細(xì)菌MEC35，在8000 r/min條件下，離心3 min，用滅菌PBS洗3次，按2%的接種量接種于上述改良阿氏無氮液體培養(yǎng)基中，以不接菌作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃ 180 r/min的條件下培養(yǎng)15 d，過濾。參照國標(biāo)HJ 636-2012采用全氮比色法[14]測(cè)定搖瓶培養(yǎng)液中的總氮含量，減去對(duì)照組中的氮含量即為菌株固定的氮量。

3 結(jié)果與分析

3.1 高效溶磷菌株的形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA序列分析

溶磷菌株在含磷酸鎂的難溶性無機(jī)磷培養(yǎng)基上的溶磷效果及該菌的革蘭氏染色結(jié)果見圖1。由圖可見，溶磷菌在含磷酸鎂的難溶性無機(jī)磷固體平板上溶磷圈直徑平均為1.68 cm。菌落為圓形，呈白色，不透明，表面光滑、凸起、濕潤，菌落邊緣完整。在顯微鏡下觀察菌株細(xì)胞形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色為陰性，不產(chǎn)生芽孢[15]。

圖1 溶磷菌溶解圈(A)、菌落形態(tài)(B)和革蘭氏染色 (C)

將溶磷菌株的16S RNA進(jìn)行測(cè)序分析比對(duì)，構(gòu)建的進(jìn)化樹見圖2。由圖2可見，該菌株與Citrobacter youngae序列相似度最高為98%，結(jié)合MEC35的菌株形態(tài)特征、革蘭氏染色和16S RNA序列的進(jìn)化分析，初步判斷菌株MEC35是一株檸檬酸桿菌(Citrobacter sp.)。

圖2 MEC35基于16S RNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 MEC35菌株對(duì)五種不同磷酸鹽溶解效果實(shí)驗(yàn)

MEC35菌株對(duì)磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉三種物質(zhì)的溶磷效果見圖3。由圖可知，MEC35對(duì)磷酸鈣的磷釋放量最大，對(duì)磷礦粉的磷釋放量最小。MEC35在0～10 h范圍內(nèi)對(duì)三種無機(jī)磷酸鹽的溶磷量較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，在30 h左右，對(duì)三種磷酸鹽的溶磷效果均達(dá)到最大，它們的溶磷濃度分別為 701.19 mg/L、872.63 mg/L、 291.22 mg/L。30 h后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，溶磷量有不同程度的降低。

對(duì)磷酸鐵和磷酸鋁的最大溶磷濃度分別只為10.63 mg/L、19.65 mg/L，達(dá)不到國家《NY/T 1847-2010》標(biāo)準(zhǔn)(70 mg/L)，因此，該菌不能溶解磷酸鋁和磷酸鐵。

3.3 MEC35菌株分泌IAA能力的測(cè)定

通過定性檢測(cè)MEC35菌株產(chǎn)生IAA實(shí)驗(yàn)，顯色結(jié)果如圖4 所示。由圖可見，MEC35反應(yīng)液為橘紅色，說明具有分泌IAA的能力，根據(jù)陽性對(duì)照組，可得知MEC35分泌IAA的量在10～20 mg/L之間。根據(jù)IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，測(cè)定出MEC35分泌IAA的濃度為16.53 mg/L，李顯剛[1]等人分離得到11株菌株，它們分泌IAA的量在9.17～42.39 mg/L之間(除一株菌株不能分泌IAA外)。跟李顯剛等人報(bào)道的結(jié)果相比，可知MEC35具有一定分泌IAA的能力。

圖3 MEC35在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)不同無機(jī)磷溶解量

3.4 MEC35菌株固氮能力的測(cè)定

MEC35在NFB無氮平板上能正常生長，說明其具有一定的固氮能力。通過測(cè)定總氮標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)，測(cè)得MEC35在無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，培養(yǎng)液中總氮濃度為20.137 mg/L，說明MEC35具有一定的固氮能力。

(1、2為50 mg/L的陽性對(duì)照，3、4為實(shí)驗(yàn)組，5、6為30 mg/L的陽性對(duì)照，7、8為10 mg/L的陽性對(duì)照，9、10為陰性對(duì)照)

4 討論

以湖北某磷礦廠周邊的土樣為材料，篩選到一株高效溶磷細(xì)菌，經(jīng)鑒定為檸檬酸桿菌(Citrobacter sp.)，命名為MEC35。實(shí)驗(yàn)表明，MEC35菌株對(duì)磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉俊具有很好的溶解作用，同時(shí)該菌株還具有產(chǎn)IAA和固氮的能力。張亮[16]等人發(fā)現(xiàn)自生固氮菌能釋放大量的氫離子，使培養(yǎng)基的 pH大幅度降低，使土壤無機(jī)磷活化。MEC35的固氮能力可以增加其溶磷能力，但MEC35菌株的溶磷機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

圖5 IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 總氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

IAA是一種植物生長激素，在一定濃度下能提高坐果率，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，MEC35具有產(chǎn)IAA的能力。因此，MEC35菌株有望作為生物肥料促進(jìn)作物生長，修復(fù)土壤，提高土壤肥力等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。