何建丹，趙海燕，朱迪冰，王少兵

(中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074)

1 引言

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種非黃酮類多酚化合物，來源于花生、葡萄、虎杖等植物中[1,2]，具有抗癌、抑菌、抗炎癥、保護心血管、調(diào)節(jié)雌激素、保護神經(jīng)和肝臟、抗氧化、美白等多種生理功能[1～4]。然而，由于白藜蘆醇生物半衰期短(8～14 min)，肝臟代謝迅速，導致其生物利用度僅為1%[4,5]?；谥|(zhì)的納米系統(tǒng)如固體脂質(zhì)納米粒(SLN)由于其亞微米尺寸，易于擴大和制造，使用生理性脂質(zhì)和控制釋放性質(zhì)而提高了親脂性化合物的口服生物利用度[5,6]。Pandita D等制備的白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒(Res-SLN)與藥物懸浮液相比白藜蘆醇生物利用度提高了8.035倍[5]。

SLN采用天然或合成的固體脂質(zhì)為載體，將藥物包裹或分散于其中制成的固體膠粒結(jié)構(gòu)體系。與其他膠體給藥系統(tǒng)相比，具有顆粒尺寸小，生物相容性好、控制藥物釋放、增強藥物靶向性等優(yōu)勢。但由于單一固體脂質(zhì)易形成完美的晶格結(jié)構(gòu)，導致在SLN儲存過程藥物被排擠出晶格，存在載藥量低、易泄露等缺點[7～10]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)是在SLN基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第二代脂質(zhì)納米載體，在固體脂質(zhì)載體中引入了一定比例的液體脂質(zhì)，打破了原有晶格，減少藥物的泄露并提高載藥量和物理化學穩(wěn)定性[10,11]。

本研究通過單因素和正交試驗，以粒徑、包封率和載藥量為指標考察白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備工藝和制劑處方。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

儀器：高效液相色譜儀(Agilent 1100型，美國Agilent公司)，電子天平(CP 214，上海奧豪斯)，高速離心機(TGL-16C，上海安亭科學儀器廠)，移液槍(Genex Beta，中國)。超濾離心管(Amicon○R Ultra-0.5，美國MILLIPORE公司)

試藥：白藜蘆醇(純度99%，阿拉丁試劑(上海)有限公司)，十二烷基硫酸鈉(天津市致遠化學試劑，批號20140520)，單硬脂酸甘油酯(天津福晨化學試劑廠，批號20140922)，油酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號20170320)，吐溫80(國藥集團化學試劑有限公司，批號20141105)，甲醇(色譜純，美國天地)；其它試劑均為市售分析純。

2.2 色譜條件

色譜柱：Dikma Platisil ODS(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，流動相：甲醇-0.3%磷酸水(65∶35)，柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL/min，檢測波長：306 nm，進樣量：10 μL。

2.3 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備方法

采用溶劑蒸發(fā)-低溫固化法制備Res-NLC[12～14]：:取處方量的白藜蘆醇、固液脂質(zhì)溶解于適量的有機溶劑中構(gòu)成油相，在高于固體脂質(zhì)熔點5～10 ℃溫度下使其充分溶解。取處方量表面活性劑溶于一定量的水中形成均勻的水相。當水相加熱至和有機相相同的溫度時，將有機相在高速均質(zhì)條件下緩慢地注入水相中，均質(zhì)一段時間后，磁力攪拌使有機溶劑完全蒸發(fā)得半透明納米乳。將所得初乳在機械攪拌下快速分散到0～2 ℃水中，冷攪拌后得白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的溶液。

2.4 包封率和載藥量的測定

超濾離心法[5,9]：取Res-NLC制劑加入1%十二烷基硫酸鈉(SDS)超聲使其充分溶解游離藥物，再取此溶液加入至超濾離心管(MW∶100 KD)，中，10000 r/min離心10 min，從外管取超濾液并用流動相稀釋，液相檢測得游離藥物含量Wfree。另取適量Res-NLC混懸液，甲醇超聲破乳5 min，測得藥物總量Wtotal。

包封率計算公式：EE%=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%;

載藥量計算公式：DL%=(Wtotal-Wfree)/[(Wtotal-Wfree)+Wlipid]×100%。

2.5 粒徑與粒徑分布

取Res-NLC混懸液適量，通過0.45 μm的微孔濾膜過濾后，用超純水稀釋，置于超聲波清洗儀中振蕩5 min，使粒子分散均勻后用動態(tài)光散射儀(DLS)進行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 制備工藝考察

按2.2節(jié)制備方法，由于選擇的脂質(zhì)熔點均在65 ℃左右，且白藜蘆醇在高溫下不穩(wěn)定，故以70 ℃作為制備溫度，保持其他條件不變，分別改變剪切時間、均質(zhì)速度、注入方式、磁力攪拌時間、冷攪拌速度及時間制備Res-NLC溶液，測定藥物的粒徑或包封率，試驗結(jié)果見表1和表2。由結(jié)果可知，其最佳制備工藝為在70 ℃時，將油相用注射器在12000 r/min均質(zhì)速度下注入水相中剪切30 min，隨后磁力攪拌0.5 h蒸發(fā)有機溶劑，并立即將形成的初乳在1000 r/min機械攪拌下冷攪拌30 min。

表2 白藜蘆醇在不同制備工藝下的包封率(n=3)

3.1.2 制劑處方考察

(1)輔料的篩選。

保持處方中其他組分不變，分別選擇不同固體脂質(zhì)、表面活性劑和有機溶劑制備Res-NLC，分別考察每組制備的納米粒的包封率。結(jié)果見表3。由表3可見，單硬脂酸甘油酯(GMS)作為固體脂質(zhì)制備Res-NLC的包封率和載藥量都較高于硬脂酸。GMS本身就是一種乳化劑，具有一定的自乳化性，可以在一定程度上起到增溶的作用，因此本實驗選擇GMS作為固體脂質(zhì)。選擇與GMS化學結(jié)構(gòu)差別較大的油酸作為液態(tài)脂質(zhì)，可以在納米顆粒中產(chǎn)生更多的晶格缺陷，這些晶格缺陷可用于儲存藥物，提高納米顆粒的載藥量。表面活性劑為吐溫80時制備的Res-NLC的包封率最高，因此選擇吐溫80作為表面活性劑。乙醇作為有機溶劑制備的NLC包封率較高，且相較于其他有機溶劑基本沒有毒性，故選擇乙醇為有機溶劑。

表3 白藜蘆醇在不同輔料中的包封率(n=3)

(2)輔料用量的選擇。

保持處方中其他組分不變，分別改變固液脂質(zhì)、藥脂比、表面活性劑和有機溶劑用量制備Res-NLC，分別考察每組制備的納米粒的包封率和載藥量，結(jié)果見表4。

表4 Res-NLC在不同輔料用量中的包封率和載藥量(n=3)

當固體脂質(zhì)：液體脂質(zhì)=1∶1時，藥物的包封率最大。液體脂質(zhì)的濃度過低時，不足以破壞單硬脂酸甘油酯的晶格結(jié)構(gòu)，而過多的液體脂質(zhì)可能不利于納米混懸液冷卻形成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，因此選擇固液脂質(zhì)比為1 : 1制備Res-NLC。

脂質(zhì)總量對制劑包封率和載藥量的影響結(jié)果表明隨著脂質(zhì)總量的增大，包封率逐漸增大，當脂質(zhì)量較大時，溶解的藥物量隨之增大，當脂質(zhì)量達到一定濃度時，投藥量一定，所以包封率增加緩慢，而載藥量隨著輔料的增加而減小。

Res-NLC包封率和載藥量隨著藥物用量的增大而減小，當投藥量大幅度增加時，會有更多的藥物向外水相逸失，因此造成包封率下降，當藥物濃度過低時，載藥量較低。隨著表面活性劑用量的增大，包封率逐漸增大。

乳化劑可以改變脂質(zhì)納米粒中脂質(zhì)的結(jié)晶行為，抑制顆粒形狀的改變，避免脂質(zhì)裸露于顆粒的表面，降低顆粒間發(fā)生聚集的可能性進而影響顆粒的穩(wěn)定性。但是乳化劑含量過高時，多出的乳化劑只有一部分覆蓋在顆粒的表面，另一部分可能以膠束的形式存在于體系中，這一部分乳化劑在體系中起不到穩(wěn)定顆粒的作用，反而會無謂的增加毒性。

隨著有機相濃度的增大，包封率先增大后減小。當有機溶劑為2 mL時，包封率最大。原因可能是當有機溶劑含量過低時，溶解的白藜蘆醇有限，使其達到過飽和狀態(tài)，使包封率降低，又保證使用有機溶劑較低原則，因此選擇有機相為2 mL制備Res-NLC。

3.2 正交試驗

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇脂質(zhì)總量、藥脂比、吐溫80的用量、納米乳與冷卻水的比例為影響因素，固定其他因素進行正交試驗設(shè)計和分析(表5和表6)。

表5 制備Res-NLC正交設(shè)計的因素和水平

表6 正交設(shè)計制備Res-NLC的最佳條件研究

由表6中的極差值可得知，各因素影響的主次順序是A>C>B>D，因此說明脂質(zhì)用量、表面活性劑用量、藥脂比、納米乳與冷卻水的比例對包封率的影響依次減弱。由此得知各因素的最優(yōu)化組合A3B2C1D2；即脂質(zhì)總量為640 mg，投藥量70 mg，表面活性劑用量200 mg，納米乳與冷卻水分散比為1∶2。

4 Res-NLC和Res-SLN的比較分析

在最佳制備工藝和最優(yōu)處方下制備Res-NLC和Res-SLN，測定其包封率、載藥量和粒徑，結(jié)果如表7。

表7 Res-NLC和Res-SLN的包封率和載藥量(n=3)

圖1 Res-NLC的粒徑分布

結(jié)果顯示，Res-NLC的包封率和載藥量均高于Res-SLN，其粒徑略低于Res-SLN。

5 討論

研究采用單因素和正交試驗設(shè)計法，以包封率、載藥量和粒徑為指標篩選白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的最佳工藝和最優(yōu)處方，并比較最優(yōu)處方下制備的Res-NLC和Res-SLN，所制備白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率為84.87%，載藥量為8.48%，均高于白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒，粒徑為252.4nm，屬于亞微米結(jié)構(gòu)，適合口服給藥和胃腸道吸收。其理化指標符合藥典關(guān)于納米粒子的質(zhì)量標準。