付繼成 江珊

[摘要]目的：分析不同類型銀屑病患者全血中Thl7細(xì)胞因子mRNA表達(dá)及血清IL-26蛋白水平。方法：選取2012年12月-2017年12月在筆者醫(yī)院接受治療的80例進(jìn)行期銀屑病患者，選取同期體檢健康者80例作為對(duì)照組，檢測(cè)兩組對(duì)象血清白細(xì)胞介素-26（IL-26）含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-26、白細(xì)胞介素-22（IL-22）、白細(xì)胞介素-17A（IL-17A）mRNA表達(dá)狀況，并行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：銀屑病及不同分型患者血清IL-26、IL-22、IL-17A mRNA表達(dá)量和IL-26蛋白含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。關(guān)節(jié)型銀屬病患者IL-26 mRNA表達(dá)量和血清IL-26含量高于尋常型銀屑病、紅皮型銀屑病和局限性膿瘡型銀屑病，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pearson相關(guān)分析顯示，患者疾病嚴(yán)重程度和IL-26蛋白含量呈正相關(guān)（r=0.702，P<0.05）。結(jié)論：銀屑病患者血清IL-26蛋白含量及IL-26、IL-22、IL-17A mRNA表達(dá)量較健康者升高，且關(guān)節(jié)型銀屑病患者IL-26 mRNA表達(dá)量高于其他類型患者。

[關(guān)鍵詞]銀屑??；Thl7細(xì)胞因子；白細(xì)胞介素-26；白細(xì)胞介素-22； mRNA

[中圖分類號(hào)]R758.63 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018） 08-0078-03

銀屑病是一種反復(fù)發(fā)作、慢性自身免疫性皮膚疾病，其病因當(dāng)前尚不完全明確，可能和感染、基因、環(huán)境及激素等因素有聯(lián)系。銀屑病患者病變組織可見大量浸潤(rùn)性白細(xì)胞、異常增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞及活化T細(xì)胞等[1-2]。相關(guān)研究顯示，角質(zhì)形成細(xì)胞與浸潤(rùn)T細(xì)胞及它們分泌的細(xì)胞因子在病情進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。在病變皮膚組織內(nèi)有大量Thl細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、γ干擾素（IFN-γ）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子，故人們認(rèn)為銀屑病中Thl細(xì)胞有重要影響。近年來，人們發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群內(nèi)Thl7細(xì)胞能夠合成白細(xì)胞介素-22（IL-22）、白細(xì)胞介素-17（IL-17），且IL-22和IL-17都參與銀屑病發(fā)病進(jìn)程，為患者體內(nèi)主要炎性細(xì)胞因子[3-5]。Thl7除了分泌IL-22與IL-17，還能夠合成白細(xì)胞介素-26（IL-26）。因此，本文通過分析不同類型銀屑病患者全血中Thl7細(xì)胞因子mRNA表達(dá)及血清IL-26蛋白水平，為臨床患者診療提供一些實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料：選取2012年12月-2017年12月在筆者醫(yī)院接受治療的80例進(jìn)行期銀屑病患者，均由2名以上副主任及以上職稱醫(yī)師確診，其中男性36例，女性44例；年齡22?60歲，平均（34.28±10.06）歲；平均病程（4.27±1.03）年；紅皮型銀屑病18例，尋常型銀屑病25例，關(guān)節(jié)型銀屑病15例，局限性膿皰型銀屑病22例；患者近1個(gè)月內(nèi)未口服免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和維A酸等藥物，近2周未進(jìn)行光化學(xué)療法或者光線療法，未外用他克莫司、維生素衍生物和糖皮質(zhì)激素等藥物，無臟器器質(zhì)性病變和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性皮膚病，肝腎功能和血常規(guī)檢測(cè)正常。

選取同期在醫(yī)院體檢健康者80例作為對(duì)照組，既往無血管炎和銀屑病等皮膚病病史，近1個(gè)月內(nèi)無感染史，其中男性39例，女性41例；年齡20?59歲，平均（35.82±10.35）歲。兩組年齡、性別等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬知情并簽署同意書。

1.2 主要儀器與試劑：臺(tái)式高速離心機(jī)（由美國(guó)Heal Force公司生產(chǎn)）、IL-26試劑盒（由美國(guó)BD公司生產(chǎn)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（由美國(guó)Applied Biosystems公司生產(chǎn)）、RN Aiso Plus（由日本TaKaRa公司生產(chǎn)）、酶標(biāo)儀（由美國(guó)Bio-RAD公司生產(chǎn)）、UltraSYBR Mixture與反轉(zhuǎn)錄試劑盒（由北京康為世紀(jì)公司生產(chǎn)）。

1.3 方法

1.3.1 血清IL-26含量檢測(cè)：采集兩組早晨空腹靜脈血5ml，使用EDTΑ-K3抗凝后搖勻，ELISA法檢測(cè)血清IL-26含量，具體步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，檢測(cè)范圍8?1 000ng/L，A值酶標(biāo)儀測(cè)量，波長(zhǎng)450mm。

1.3.2 血清Thl7 mRNA含量檢測(cè)：100ml全血和200mlRNAiso Plus放入離心管內(nèi)，氯仿加入后搖勻，離心機(jī)3 000rmp離心10min，取上清液移到另外離心管內(nèi)，異丙醇加入后搖勾，靜置8min后離心機(jī)lOOOOrmp離心12min。上清液倒掉，加入750ml 75%乙醇，離心機(jī)lOOOOrmp離心6min后將上清液倒掉，干燥沉淀6min。無RNA酶去離子水將RNA沉淀全部溶解以后，紫外分光光度儀檢測(cè)，讀取260nm及280nmA值，A260nm/A280nm比值為1.8?2.0，并估算核酸純度。

使用SuperQuickRT Mas-ter Mix行RNA反轉(zhuǎn)錄，依據(jù)試劑盒行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為38°C下16min，86°C下5s。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用UltraSYBR Mix-ture擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體積50ml；引物正義鏈與反義鏈，IL-26： 5 -GCTATCGGTTAACGTAGTAC-3，

5-TGGACTGACGAGGGAAGCG； β-actin：

5-TAAGCTCGGCCCTTACCAAT-3，

5- CTTAGCCAATTGCGTAGGGT-3； IL-22： 5-ATTCGACGTACGAACTGGTT-3，

5-TAAGTGACGCGAGCGACCTG-3； IL-17A ：5-ACCTAGCTACTGGACAGTTΑ-3，5-TCCGGTATTATGGAGTCCAG-3。反應(yīng)條件，95°C下10min，95°C變性 15s，60°C 下退火lmin，60°C 下延伸lmin，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線，95°C下15s，60°C下lmin，95°C下 15s， 60°C下 15s。內(nèi)參為β-actin，2-△ct表示結(jié)果，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料 表示，單因素方法分析，兩兩對(duì)比檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料行；χ2檢驗(yàn)；Pearson行相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清IL-26、IL-22、IL-17A mRNA表達(dá)及IL-26含量比較：銀屑病組及不同分型組患者血清IL-26、IL-22、IL-17A mRNA表達(dá)量和IL-26蛋白含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；關(guān)節(jié)型銀屑病患者IL-26 mRNA表達(dá)量和血清IL-26含量高于尋常型銀屑病、紅皮型銀屑病和局限性膿皰型銀屑病，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析顯示，患者疾病嚴(yán)重程度和IL-26蛋白含量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0=0.702， PC0.05）。

3 討論

當(dāng)前IL-26相關(guān)生物學(xué)功能研究不是很多，國(guó)外一些專家曾報(bào)道克羅恩病患者血清內(nèi)IL-26含量上升，同時(shí)可誘引腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8及TNF-α[6-7]。Dambacher等[8]研究顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔積于血清內(nèi)IL-26含量都上升，并且可加速單個(gè)核細(xì)胞形成TNF-α與IL-8等一些細(xì)胞因子。銀屑病患者血清IL-26作用因素目前還不太明確，IL-26受體在皮膚角質(zhì)所產(chǎn)生細(xì)胞表層表達(dá)，同時(shí)誘發(fā)分泌IL-8，這可能為銀屑病患者發(fā)病中IL-26參與機(jī)制影響[9-12]。

本文研究顯示，關(guān)節(jié)型患者IL-26 mRNA表達(dá)量高于尋常型、紅皮型和膿皰型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能因?yàn)槌齌hl7產(chǎn)生IL-26外，關(guān)節(jié)型患者發(fā)生病變關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜細(xì)胞也會(huì)形成IL-26。當(dāng)前對(duì)于IL-22與IL-17生物學(xué)功能研究已比較深入，但I(xiàn)L-26生物學(xué)功能不是太清楚。IL-17包含IL-17F、IL-17E和IL-17A等，主要為IL-17A，它可以將MAPK、NF-kB信號(hào)路徑激活，進(jìn)而引發(fā)多種效應(yīng)，誘使中性粒細(xì)胞聚集與活化，并對(duì)炎癥組織內(nèi)中性粒細(xì)胞凋亡其抑制作用[13-15]。另外，IL-17A還能夠加速形成機(jī)制金屬酶與血管生成素，進(jìn)而加快修復(fù)與生成組織血管。IL-17A對(duì)TNF-α有協(xié)同影響，加速釋放TNF-α、IL-1P與IL-6，使體內(nèi)炎癥程度加重。IL-22為Thl7所分泌主要炎癥因子，它可加速角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，IL-22可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分解抗微生物氨基酸肽和基質(zhì)金屬酶，同時(shí)銀屑病患者病情程度和血清IL-22含量相關(guān)[16-18]。由于IL-26和IL-22都用相似氨基酸序列，為IL-10細(xì)胞家族，同時(shí)都是Thl7所分泌，因此，IL26是否有和IL-22近似生物功能還需行更深入研究。

綜上所述，雖然本研究驗(yàn)證了銀屑病患者血清內(nèi)IL-26含量上升，且關(guān)節(jié)型患者含量比其他類型患者含量更高，和銀屑病病情嚴(yán)重程度為正相關(guān)，這說明IL-26可為銀屑病，特別是關(guān)節(jié)型銀屑病患者診療輔助指標(biāo)。由于人力和時(shí)間等限制，本文樣本量偏少，且沒有對(duì)銀屑病起病中IL-26的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，因此，IL-26若要作為關(guān)節(jié)型銀屑病患者診斷輔助指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，還需進(jìn)一步行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和大樣本臨床研究。

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