魏 巍，周琪樂，紀(jì)鳳娣，陶匯源，魯 緋，夏 蓉*

（1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

鎮(zhèn)江香醋（普通醋和陳年醋）作為我國的四大名醋之一，是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食醋的典型代表，其特有的“固態(tài)分層發(fā)酵”多菌種混合釀造工藝是世界非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，賦予鎮(zhèn)江香醋別具一格的風(fēng)味和獨特的口感。它具有“酸而不澀，香而微甜，色濃而味鮮，愈存愈香”的特點[1-2]。千百年來，食醋不但是調(diào)味不可缺少的佳品，還是一種醫(yī)藥良藥。研究表明釀造食醋含有豐富的營養(yǎng)成分，具有獨特的藥理作用[3-4]。釀造食醋中含有有機(jī)酸、氨基酸、酚類、黃酮類和吡嗪類等活性物質(zhì)，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)血脂、降血壓、抗氧化、抗癌、促進(jìn)食欲、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種生理功能，其中黃酮類和酚類、多酚類等類黃酮物質(zhì)具有重要生物活性及保健功能，能起到抗炎、抗氧化、抗癌等作用[5-7]。因此，研究建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的同時測定食醋中多種黃酮類物質(zhì)的分析方法顯得尤為重要。

近年來，對橙皮素[8-9]、牡荊素[10]、表兒茶素、柚皮素、山柰酚[11-12]、槲皮素[13-14]、金絲桃苷[15-16]、木犀草素[17]、柚皮苷[18-19]和橙皮苷[20-21]等黃酮類化合物生物功能的研究報道較多，這些物質(zhì)均為黃酮類或類黃酮類化合物，具有類似的分子結(jié)構(gòu)和天然的生理活性。目前采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對這十種黃酮類化合物中某個成分或是多個成分在植物[8，14，21，25，27，29]、中成藥[26，30，32]、食品[22，31]和生化樣品[23-24，28]中的含量分析的報道比較多見，而對于發(fā)酵食品，特別是釀造食醋進(jìn)行多指標(biāo)黃酮類化合物的定量分析卻少見報道。迄今為止，對鎮(zhèn)江香醋中有機(jī)酸、氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)的研究較多[4-7]，對黃酮類和類黃酮類化合物的研究報道仍以生物活性的研究為主。本研究對鎮(zhèn)江普通醋和陳年醋中上述十種黃酮類化合物的含量進(jìn)行了分析，建立了一種測定釀造食醋中十種黃酮類物質(zhì)含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performanceliquid chromatography-tandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS）法?？梢宰鳛槭炒字悬S酮類物質(zhì)定量檢測的理論依據(jù)，為食醋中這類化合物的綜合利用提供參考。

圖1 十種黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of ten kinds of flavonoids compounds

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮(zhèn)江普通醋、陳年醋：江蘇恒順集團(tuán)有限公司。

柚皮素（純度≥99%）、木犀草素（純度≥99%）、山奈酚（純度≥98.5%）、表兒茶素（純度≥98%）、橙皮素（純度≥98.5%）、牡荊素（純度≥98%）、金絲桃苷（純度≥99%）、柚皮苷（純度≥98.5%）和橙皮苷（純度≥98%）：成都普思生物科技股份有限公司；槲皮素（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（均為色譜純）：Fisher scientific；甲酸（分析純）：北京化工廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水采用Mili-Q制備。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）：美國Waters公司；2200TH超聲波清洗機(jī)：上海安譜實驗科技股份有限公司；EYELA OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；Centrifuge 5430高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

柚皮素、木犀草素、山奈酚、表兒茶素、橙皮素、牡荊素、金絲桃苷、柚皮苷、橙皮苷和槲皮素十種黃酮類化合物用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇水溶液配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用時逐級稀釋為25 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確移取食醋樣品2.0mL于10mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇水溶液（V/V）8.0 mL，超聲處理30 min（功率100 W），混勻后以6 000 r/min離心5 min，吸取上層清液過0.22 μm膜后備用。

1.3.3 超高效液相色譜和質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱溫35℃，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流速0.4 mL/min，流動相梯度：0→1.0 min，B相5.0%；1.0→3.0 min，B相5.0%→90.0%；3.0→3.5 min，B相90.0%→5.0%；3.5→5.5 min，B相5.0%→5.0%。

質(zhì)譜條件：離子化模式為電噴霧電離（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度200℃，去溶劑輔助加熱溫度350℃；去溶劑氣以及霧化器均采用高純氮氣（N2），去溶劑氣和錐孔反吹氣流速分別為500 L/h和50 L/h，碰撞氣為高純氦氣（He），流速為0.4 mL/min；目標(biāo)物電離毛細(xì)管電壓2 000 kV；引導(dǎo)目標(biāo)母離子進(jìn)入錐孔的錐孔電壓45 V；影響母離子裂解程度的碰撞能量優(yōu)化后的具體參數(shù)見表1。

表1 十種黃酮類化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS analysis parameters of ten kinds of flavonoids compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系和范圍

對鎮(zhèn)江普通醋和陳年醋中十種黃酮類物質(zhì)含量分析的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖見圖1。

將質(zhì)量濃度分別為25 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL的各混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化后的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，得到以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

由表2可知，十種待測成分在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均≥0.99。以3倍的信噪比確定各化合物的檢出限，結(jié)果表明柚皮素、木犀草素、山奈酚、表兒茶素、槲皮素、橙皮素、牡荊素、金絲桃苷、柚皮苷和橙皮苷的檢出限分別為4.0 ng/mL、2.0ng/mL、1.0ng/mL、4.0ng/mL、1.0ng/mL、4.0ng/mL、1.0ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL和1.0 ng/mL。

圖2 鎮(zhèn)江普通醋和陳年醋中十種黃酮類物質(zhì)含量超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜色譜分析色譜圖Fig.2 Chromatogram of ten kinds of flavonoids compounds in Zhenjiang ordinary vinegar and aged vinegar analysis by UPLC-MS/MS

表2 十種黃酮類化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient,linear range and detection limits of ten kinds of flavonoids compounds

2.2 精密度試驗

取500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3.3的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針，結(jié)果見表3。由表3可知，各組分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為柚皮素1.1%，木犀草素1.3%，山奈酚1.5%，表兒茶素2.6%，槲皮素2.2%，橙皮素1.8%，牡荊素1.9%，金絲桃苷1.6%，柚皮苷1.1%，橙皮苷1.4%，RSD均＜5%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of precision tests

2.3 加標(biāo)回收率試驗

準(zhǔn)確移取2.0 mL鎮(zhèn)江普通醋樣品共18份，樣品1～6號、樣品7～12號和樣品13～18號分別加入質(zhì)量濃度為10.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL、50μL、10μL，按照1.3.2和1.3.3試驗條件進(jìn)行樣品處理和分析測定，得到各組分的加標(biāo)回收率見表4。由表4可知，十種化合物的平均加標(biāo)回收率為93.9%～99.0%，測得各成分加標(biāo)回收試驗結(jié)果的平均RSD分別為柚皮素2.3%，木犀草素1.7%，山奈酚2.6%，表兒茶素1.9%，槲皮素3.5%，橙皮素2.9%，牡荊素1.7%，金絲桃苷2.2%，柚皮苷3.8%，橙皮苷2.4%，RSD均＜5%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表4 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rate tests

續(xù)表

2.4 樣品中黃酮類物質(zhì)含量測定

準(zhǔn)確移取鎮(zhèn)江普通醋和陳年醋樣品2.0 mL，按照1.3.2和1.3.3試驗條件進(jìn)行樣品處理和測定，測得各組分的含量見表5。由表5可知，鎮(zhèn)江普通醋和陳年醋中分別檢出4種、5種黃酮類化合物，共有黃酮化合物為金絲桃苷、柚皮苷及橙皮苷，兩種醋中黃酮類化合物的組成不同，木犀草素僅在鎮(zhèn)江普通醋中檢出，而山奈酚和牡荊素僅在陳年醋中檢出。在兩種香醋中金絲桃苷的含量分別高達(dá)0.948μg/100mL和0.772 μg/100 mL，黃酮類化合物的總含量相似，分別為1.712 μg/100 mL和1.716 μg/100 mL。

表5 鎮(zhèn)江普通醋和陳年醋種各黃酮類化合物的含量Table 5 Contents of each flavonoids compounds in Zhenjiang ordinary vinegar and aged vinegar

3 結(jié)論

本實驗建立了一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的UPLC-MS/MS方法，可同時檢測鎮(zhèn)江香醋中柚皮素、柚皮苷、橙皮素、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、金絲桃苷、牡荊素、槲皮素和表兒茶素共十種黃酮類化合物的含量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分在普通C18色譜柱上就能很好的實現(xiàn)分離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式可有針對性的選擇數(shù)據(jù)采集質(zhì)譜信號，通過兩級離子選擇排除干擾離子，能實現(xiàn)10種黃酮類成分的同時測定。在探索離子掃描模式時發(fā)現(xiàn)，在負(fù)離子模式下黃酮類成分響應(yīng)較好。對甲醇和乙腈作為流動相時的色譜分離情況的考察發(fā)現(xiàn)，乙腈在實現(xiàn)分離的同時縮短了實驗時間，并且加入0.1%的甲酸能很好的修飾峰形。研究結(jié)果證明以0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相，采用梯度洗脫的方法，流速為0.4 mL/min時，不僅保留時間適當(dāng)，而且分離度良好。方法學(xué)考察表明該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》中的規(guī)定。本實驗所建立的方法準(zhǔn)確、靈敏，色譜、質(zhì)譜條件經(jīng)過優(yōu)化能在5.5 min內(nèi)實現(xiàn)釀造食醋中十種黃酮類成分的含量測定。