董勝勝，李 瀟，王鵬飛，付肖蒙，肖冬光，董 健*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

酵母多數(shù)普遍存在于富含糖類的環(huán)境（如水果、蔬菜、花蜜和植物分泌物中，以及果園和部分富含石油的土壤）中。目前最常見且應(yīng)用最為廣泛的酵母菌種當(dāng)屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母是一種單細胞真核微生物，形態(tài)多為球形、橢圓形、卵圓形及臘腸形，其個體大小也會隨菌種的不同而有所差異[1]，但比細菌的單細胞個體要大的多，一般為1～5 μm或5～20 μm，其細胞的長寬比例為1～2左右。而溫度是酵母細胞代謝活動重要的影響因素，一般來說，28～30℃是其最適生長溫度，30～33℃是其最適發(fā)酵溫度[2]。不但酵母細胞的生長繁殖會受溫度的影響，而且酵母細胞細胞膜的組成成分也受溫度的影響[3]。如麥角固醇[4]、飽和及不飽和脂肪酸[5]、磷脂酰膽堿[6]等細胞膜成分會發(fā)生改變，這些成分的改變共同使酵母細胞在高溫狀態(tài)下保持膜的流動性。ASKWITH C等[7]研究表明，銅離子環(huán)境中SOD1酶能讓酵母細胞具有高溫耐受性，在39℃條件下SOD1酶缺失菌株不能生長，過量添加銅離子也不能使其回復(fù)生長。這種情況說明超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在酵母細胞高溫耐受性方面起著重要的作用。HASLBECK M等[8]研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白（heatshock protein，Hsp）與細胞的耐熱性也有聯(lián)系。研究表明，熱休克蛋白是組成型和誘導(dǎo)型的高溫響應(yīng)蛋白的統(tǒng)稱。熱休克蛋白充當(dāng)分子伴侶的角色，起促進蛋白質(zhì)的重新折疊、修復(fù)受損蛋白、降解多余基質(zhì)的作用。

在轉(zhuǎn)錄水平上，熱休克蛋白調(diào)控酵母的應(yīng)答機制，提高細胞的高溫耐受性。SANCHEZY等[9]過量表達基因HSP104，提高了酵母細胞的高溫耐受性。另外，研究發(fā)現(xiàn)主要因為熱休克蛋白修復(fù)蛋白時，海藻糖起到了協(xié)助作用[10-11]，才使其能夠保護細胞。越來越多的研究表明環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路中的CYR1基因、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）[12]等活性的改變也能提高細胞的高溫耐受性。cAMP信號通路在調(diào)控酵母細胞代謝、增殖、分化及壓力抗性的獲得過程中具有重要的作用[13-15]。而cAMP信號通路對酵母細胞的脅迫抗性具有很大的調(diào)節(jié)作用，MSN4基因?qū)儆赾AMP信號通路中的壓力調(diào)控因子，cAMP信號通路活性的提高就會抑制一些與壓力響應(yīng)元件相關(guān)基因的表達，其中轉(zhuǎn)錄因子Msn4對壓力響應(yīng)元件相關(guān)的一些基因的表達是必須的，是cAMP信號通路抑制壓力響應(yīng)相關(guān)基因表達的靶標[16-18]。Msn4是鋅指蛋白，在對溫度敏感型snf1突變株多拷貝抑制物進行分離的過程中得到MSN4基因，它可直接或間接的影響胞內(nèi)cAMP水平，進而影響蛋白激酶A（PKA）的活性。有大量文獻表明，蛋白激酶A活性的高低與菌株的耐溫性呈現(xiàn)負相關(guān)，蛋白激酶A活性高的菌株具有較低的脅迫耐受性。這些基因的過表達還可能與酵母細胞的其他耐受性有關(guān)，如細胞的耐高滲透壓、高乙醇及高乙酸等。Msn4這個反式作用元件在壓力反應(yīng)元件（stress response element，STRE）介導(dǎo)的基因表達方面發(fā)揮作用。當(dāng)MSN4過量表達時可以抑制突變snf1基因的熱敏性[19]。

本研究以實驗室菌株AY12a為出發(fā)菌株，通過胞內(nèi)同源重組法，利用基因工程操作手段將PGK1p啟動子插入MSN4基因的N端，接著進一步篩選驗證得到改造后的菌株AY12a-msn4，從生長性能，高溫、15%乙醇的耐受性、6%NaCl和5%乙酸等指標考察突變株的綜合耐受性的改變，同時將突變株與出發(fā)菌株進行玉米高溫濃醪發(fā)酵實驗，并測定發(fā)酵完成后的酒度、殘?zhí)恰?8 h細胞存活率、CO2失重和發(fā)酵時間。比較突變株及親本菌株的發(fā)酵性能，研究過表達基因?qū)︶劸平湍笣怩舶l(fā)酵性能的影響。構(gòu)建出一株高耐性菌株AY12a-msn4，不僅可以提高人們對釀酒酵母耐受性的認識，而且可用于工業(yè)生產(chǎn)中，增加原料的利用率，可獲取更大的效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本研究所使用的釀酒酵母菌株及獲得的突變株見表1。

表1 實驗所使用的菌株Table 1 Strains used in this experiment

1.1.2 酶和試劑

r Taq DNA聚合酶：大連TaKaRa公司；尿嘧啶：北京泛基諾科技有限公司；α-淀粉酶（150 000 U/mL）、糖化酶（290 000 U/mL）、酸性蛋白酶（100 000 U/mL）：諾維信（中國）投資有限公司。

葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司。其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉。

合成缺陷（synthetic dropout，SD）培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，6.7 g/L無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB），1.3 g/L尿嘧啶。

耐鹽培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，NaCl 60 g/L。

耐乙醇培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，加入15 mL/L的無水乙醇。

耐乙酸培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，5 mL/L的乙酸。

醋酸鉀（potassium acetate，KAC）生孢培養(yǎng)基：20 g/L的醋酸鉀，用蒸餾水定容至100 mL。

上述培養(yǎng)基pH自然，用蒸餾水定容至100 mL，在1.0×105Pa條件下115℃滅菌15～20 min，另外固體培養(yǎng)基額外添加20 g/L的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16C臺式離心機：上海安亭科技儀器廠；UVmini-1240島津紫外分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；GL20A型高速冷凍離心機：中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司；PCT-200型聚合酶連反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀：美國BIO-RAD公司；Gel Logic212全自動凝膠成像儀：美國SYN gENE公司；AB204-S型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海公司；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；BX43奧林巴斯生物顯微鏡：日本OLYMPUS會社；博歐特血球計數(shù)板：上海求精生化試劑有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計與合成

表2 PCR引物設(shè)計Table 2 Design of PCR primer

1.3.2 基因過表達組件的構(gòu)建

圖1 過表達MSN4基因的構(gòu)建過程Fig.1 Construction process of overexpression of MSN4 gene

本實驗以MSN4基因作為靶基因，野生型釀酒酵母工業(yè)菌株AY12a為親本菌株，URA3基因為篩選標記，在MSN4基因的N端加入強啟動子PGK1p，以實現(xiàn)MSN4基因的過表達。同時設(shè)計4對引物，PCR擴增獲得帶有同源臂的4個片段，即MSN4上同源臂片段（其3'端含有URA3序列5'端同源序列）、URA3片段（其5'端含有MSN4序列3'端同源序列、其3'端含有PGK1序列5'端同源序列）、PGK1片段（其5'端含有URA3序列3'端同源序列、其3'端含有MSN4下同源臂片段5'端同源序列）、MSN4下同源臂片段（其5'端含有PGK1序列3'端同源序列）。將4個擴增片段進行PCR純化回收，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將純化后的片段導(dǎo)入到受體菌株AY12aΔU（URA3基因突變菌株）完成同源序列之間的同源重組，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于省卻尿嘧啶的SD培養(yǎng)基上，生長2～3d后得轉(zhuǎn)化子，單菌落進行純化，精提基因組并以此為模板進行PCR。由于受體菌株AY12aΔU含有突變的URA3基因，經(jīng)醋酸鋰化轉(zhuǎn)后同源重組正確的轉(zhuǎn)化子在SD培養(yǎng)基上可以生長，以此篩選正確轉(zhuǎn)化子。AY12a-msn4突變株的構(gòu)建過程見圖1。

1.3.3 釀酒酵母細胞生長曲線的測定

本實驗采用全自動生長曲線測定儀測定OD600nm值，操作步驟如下：挑取斜面菌種1環(huán)接至5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h；吸取上述培養(yǎng)好的菌液40 μL接入裝有360 μL液體YEPD培養(yǎng)基的100孔板的孔中，將100孔板置于設(shè)定的溫度下培養(yǎng)，以YEPD液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔0.5 h測定波長600 nm處的OD600nm值，以時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.4 釀酒酵母細胞耐受性的測定

從斜面挑取一環(huán)酵母菌泥，接入5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)過夜。測OD600nm值，取適量菌液轉(zhuǎn)接入5 mL新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，使其初始OD600nm值為0.15。將上述細胞培養(yǎng)4～6 h至生長對數(shù)期，測量OD600nm值，用YEPD液體培養(yǎng)基調(diào)整所有細胞OD600nm值為1.0，以保證所有細胞初始菌體濃度一致。移液槍分別移取100 μL的菌液于1.5 mL離心管中，實驗組用55℃水浴4 min熱擊處理，對照組不做任何處理。

將實驗組和對照組分別用無菌水稀釋相同的濃度梯度，按照濃度遞減的順序，每個稀釋度分別取2 μL的菌液整齊的滴于YEPD固體培養(yǎng)基、耐鹽培養(yǎng)基、耐乙醇的培養(yǎng)基、耐乙酸培養(yǎng)基平板上，超凈臺晾干后，封口膜封好倒置于30℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體的生長，比較不同菌株的耐熱、耐鹽、耐乙醇及耐乙酸情況。

1.3.5 玉米濃醪發(fā)酵

召開會議是部署、落實和推動黨委和政府工作的慣常手段，但開會過多過濫，會導(dǎo)致行政效率下降，形式主義抬頭，工作作風(fēng)漂浮。中央的八項規(guī)定，其中明確要求精簡會議活動，切實改進會風(fēng)；但“文山會?！爆F(xiàn)象在一些地方和部門屢禁不絕。這其中難免有官僚主義思想作祟，覺得開會才算重視，才是部署工作應(yīng)有的儀式。

（1）玉米水解液的制備

稱取1 500 g的玉米粉，并向其加入4 500 mL 65～70℃的自來水放置20min，讓玉米顆粒充分吸水膨脹，然后加入液化酶0.9 mL，在85～90℃水浴液化1.5 h，然后加入糖化酶3 mL于60℃水浴20 h。最后將糖化液用3層濾布過濾及可得到澄清的濾液，即為玉米水解液，煮沸滅菌后可用。

（2）種子培養(yǎng)基的制備

一級種子培養(yǎng)：調(diào)玉米水解液糖度為8°Bx，分裝各5mL，同時加入酵母粉0.5%，煮沸15～20 min，冷卻至室溫后接10%的菌液，30℃條件下靜置24 h。

二級種子培養(yǎng)：稀釋玉米水解液糖度為12°Bx，每組取45 mL同時加入酵母粉0.5%，經(jīng)過煮沸15min后，冷卻后把一級種子液倒入二級培養(yǎng)液中，30℃條件下靜置培養(yǎng)16 h。

（3）玉米濃醪發(fā)酵

稱量60 g玉米粉于250 mL三角瓶中，加入130 mL 60～70℃的水，放置20 min糊化后加入耐高溫α-淀粉酶0.03mL，混勻后升溫至85～90℃液化1.5h，再降溫至55～60℃，加入液化酶0.09 mL及營養(yǎng)鹽1 mL，糖化20 min后，降溫至40℃加入1.2mL的酸性蛋白酶反應(yīng)20min，然后降溫至30℃接菌5mL，每組需3個平行實驗。從接菌后，每12 h稱質(zhì)量一次，直至兩次稱質(zhì)量的差＜1 g則可停止發(fā)酵，進行蒸餾。

1.3.6 分析檢測

利用酒精比重計來對酒精產(chǎn)量進行測定；采用斐林試劑法對發(fā)酵完成后的還原糖進行測定；采用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)測定細胞存活率，其計算公式如下：

式中：X為釀酒酵母發(fā)酵48 h后細胞存活率，%；C1為血球計數(shù)板中經(jīng)過次甲基藍染色劑染色后著色的細胞數(shù)，個；C2為血球計數(shù)板中全部的細胞數(shù)，個。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴增

以親本菌株AY12a為模板，利用引物對MSN4上同源臂U和MSN4上同源臂D、MSN4-URA3U和MSN4-URA3D、MSN4-PGK1p U和MSN4-PGK1p D、MSN4下同源臂U和MSN4下同源臂D進行PCR擴增帶有部分同源的4個基因片段，其片段長度大小見圖2。由圖2可知，泳道1～4依次為825 bp、848 bp、1 519 bp、1 918 bp，與預(yù)期片段大小一致，可用于下一步實驗。

圖2 帶有同源臂的MSN4片段擴增驗證電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of amplification verification of MSN4 fragment with homologous arm

2.2 突變株的獲得與驗證

提取陰性對照AY12a基因組及驗證正確的菌株基因組，分別利用驗證引物進行驗證?？梢岳靡飳︱炞CMSN4基因上的同源臂-URA3U和驗證MSN4上的同源臂-URA3D、接著可以驗證PGK1p-MSN4U和驗證PGK1p-MSN4D、驗證URA3-PGK1p U-MSN4和驗證URA3-PGK1pD-MSN4進行過表達MSN4基因菌株進行定點驗證，結(jié)果見圖3。由圖3可知，MSN4基因擴增出大小為1 021 bp、2 921 bp、1 433 bp的特異性片段，與預(yù)期大小一致，且陰性對照PCR后無此條帶，說明AY12a-msn4突變株已成功構(gòu)建。

圖3 定點PCR驗證MSN4電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of verification of MSN4 by site-directed PCR

2.3 細胞融合生孢

采用標準AY12α型單倍體與改造后的突變菌株AY12amsn4進行雜交融合，生成二倍體，將生成的二倍體進行擴大培養(yǎng)，涂布在KAC生孢培養(yǎng)基上進行生孢，分離單倍體，對分離出來的單倍體進行三引物驗證和引物對驗證MSN4上同源臂-URA3U和驗證MSN4上同源臂-URA3D、驗證PGK1p-MSN4和驗證PGK1p-MSN4D、驗證URA3-PGK1pUMSN4和驗證URA3-PGK1pD-MSN4，以獲得α型突變株AY12α-msn4。根據(jù)以上結(jié)果，將分離出來的各個單倍體用過表達基因的驗證引物對分離出來的單倍體進行PCR驗證，結(jié)果見圖4。由圖4可知，泳道1～3是驗證過表達MSN4基因的片段，片段大小分別是1 021 bp、2 921 bp和1 433 bp。PCR結(jié)果均與a型突變株的PCR結(jié)果相一致，說明成功獲得α型突變株AY12α-msn4。

圖4 菌株AY12α-msn4的PCR驗證電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of PCR verification of strain AY12α-msn4

2.4 釀酒酵母基因突變株與親本菌株生長性能的比較

對親本菌株AY12a-msn4突變菌株根據(jù)1.3.3所示方法進行生長曲線的測定。挑取一環(huán)AY12a和AY12a-msn4菌泥接種于5 mL YPED液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，然后對親本菌株和突變株在30℃和40℃條件下進行生長曲線的測定，結(jié)果見圖5。

圖5 突變菌株和原始菌株在30℃（A）及40℃（B）條件下的生長曲線Fig.5 Growth curves of the mutant and the original strains under 30℃(A)and 40℃(B)conditions

由圖5可知，在30℃的培養(yǎng)條件下AY12a-msn4與親本菌株AY12a的生長速度相比，生長性能基本一致；當(dāng)生長溫度改為40℃時，高溫對突變株AY12a-msn4的生長影響較大，較親本菌株AY12a菌體濃度沒有明顯的提高，且生長對數(shù)期延長，由于所測樣品菌液都稀釋了10倍，故生長15 h后，理論上菌濃OD600nm值可達到1.5左右。具體的生長情況需要用玉米高溫濃醪發(fā)酵驗證。

2.5 釀酒酵母基因突變株與親本菌株耐受性的比較

按照材料與方法中1.3.4中所描述的方法測定出發(fā)菌株AY12a以及突變菌株AY12a-msn4在55℃熱擊4 min處理，在15%（V/V）的乙醇、6%的NaCl及5%（V/V）乙酸的脅迫環(huán)境下進行耐受性分析，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，在沒有生長壓力的YEPD平板上，出發(fā)菌株AY12a和突變株AY12a-msn4的生長情況基本上是一致的，可見用做耐受性實驗的出發(fā)菌株以及突變菌株的初始菌體濃度基本上保持是一致的。在55℃熱擊4 min處理造成的環(huán)境壓力下，出發(fā)菌株AY12a和突變菌株的生長都受到了很大程度的抑制。但相比出發(fā)菌株，在相同的稀釋倍數(shù)下，AY12a-msn4的菌落數(shù)較多，說明其熱擊抗性強于出發(fā)菌株并且優(yōu)于出發(fā)菌株AY12a；在15%（V/V）的乙醇和6%的NaCl造成的環(huán)境壓力下，相同的稀釋倍數(shù)下，AY12a-msn4和突變株的菌落數(shù)均低于原菌；在5%（V/V）乙酸造成的環(huán)境壓力下，相比出發(fā)菌株AY12a，突變菌株AY12a-msn4沒有較大的變化，說明5%（V/V）的乙酸對這些突變株的生長沒有協(xié)迫性。

圖6 突變菌株和原始菌株的耐受性Fig.6 Tolerance of the mutant and the original strains

2.6 釀酒酵母基因突變株與親本菌株的玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵

表3 突變菌株的發(fā)酵性能和細胞存活率Table 3 Fermentation performance and cell survival rate of the mutant strain

將改造后的菌株AY12a-msn4和出發(fā)菌株AY12a進行玉米高溫濃醪發(fā)酵。待發(fā)酵進行48 h后，將發(fā)酵液搖勻，取樣液，用3層紗布濾去玉米渣，用無菌水稀釋至合適倍數(shù)，進行次甲基藍染色后，放大倍數(shù)×400顯微鏡下檢測48 h細胞存活率。待發(fā)酵完成后，測定發(fā)酵液中乙醇含量，按照方法測定發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮?，結(jié)果見表3。

由表3可知，在38℃濃醪發(fā)酵中，突變株AY12a-msn4酒精度相比出發(fā)菌株AY12a提高了3.85%，表明其出酒率得到提升；殘?zhí)呛肯陆?4.5%，說明改造菌的發(fā)酵性能較好，對原料的利用率高；48 h主發(fā)酵完成后的細胞存活率提高了72%。正常釀酒酵母的發(fā)酵時間為72 h[20]，而改造菌AY12a-msn4發(fā)酵時間延長了12 h，與生長曲線測定的結(jié)果一致。酵母細胞發(fā)酵時間的延長，常伴隨著細胞耐受性的增加，比如高乙醇、高溫、高滲透壓等，但AY12a-msn4突變株沒有取得預(yù)期的效果，可能是由于菌株自身的遺傳背景和特異性所導(dǎo)致的。

3 結(jié)論

本研究以實驗室現(xiàn)有菌種AY12a為出發(fā)菌株，URA3基因為篩選標記，通過基因操作來實現(xiàn)MSN4基因的過表達，即提高該基因的表達活性，從而可成功構(gòu)建過表達MSN4基因的突變菌株AY12a-msn4。然后對突變株AY12a-msn4進行耐受性的測定，發(fā)現(xiàn)突變株AY12a-msn4對高溫有一定的耐受性。同時將突變株與出發(fā)菌株AY12a進行玉米原料高溫濃醪發(fā)酵實驗，并測定發(fā)酵完成后的各個參數(shù)。突變株AY12a-msn4的乙醇含量較出發(fā)菌株AY12a提高了3.85%，48 h細胞存活率提高，殘?zhí)呛肯陆?。因此?gòu)建的菌株AY12a-msn4可以作為工程菌株，運用于發(fā)酵行業(yè)。