王 瑩，劉鳳霞*，王文慶，蘇舉一，薛 剛，皮 倩

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004；3.河南佳尚農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，河南 魯山 467300）

沙棘果中富含沙棘黃酮、維生素C（vitamin C，VC）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等有保健作用的活性物質(zhì)，具有抗衰老、抗氧化等作用[1-4]。沙棘果漿經(jīng)發(fā)酵后制成的沙棘果酒營(yíng)養(yǎng)成分豐富[5-6]，在發(fā)酵果酒時(shí)常添加60 mg/L的二氧化硫進(jìn)行發(fā)酵。二氧化硫主要是抑菌、抗氧化，二氧化硫影響酒的質(zhì)量，能與果酒中的色素結(jié)合，生成無(wú)色的加成產(chǎn)物對(duì)酒具有漂白作用，SO2可抑制蘋果酸-乳酸發(fā)酵，許多果酒都要進(jìn)行該反應(yīng)，但酒中游離SO2對(duì)乳酸菌有強(qiáng)烈的抑制作用，而二氧化硫?qū)υ撨^(guò)程的抑制與游離二氧化硫濃度有關(guān)，當(dāng)其濃度較低時(shí)，抑制作用較小，濃度高時(shí)，這一過(guò)程明顯推遲，當(dāng)濃度更高時(shí)，這一過(guò)程直接不能進(jìn)行[7]。牛廣財(cái)?shù)萚8]對(duì)沙棘果酒主發(fā)酵工藝的研究發(fā)現(xiàn)，沙棘中二氧化硫的最適添加量為80～120 mg/L。由于二氧化硫?qū)θ说慕】荡嬖谝欢ǖ挠绊?，需要研究新型的抗氧化劑添加到果酒發(fā)酵中。文獻(xiàn)報(bào)道[9]在果酒中添加的新型抗氧化劑有乙二胺四乙酸二鈉、植酸、茶多酚、竹葉黃酮等。迷迭香提取物中迷迭香酸的抗氧化作用最明顯，而且與其他抗氧化劑相比，具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此推薦其在食品中使用[10]。

本實(shí)驗(yàn)以沙棘果漿為原料，以不添加、添加抗氧化劑迷迭香酸或二氧化硫進(jìn)行果酒發(fā)酵，并對(duì)果酒進(jìn)行抗氧化性測(cè)定和澄清實(shí)驗(yàn)，為沙棘果酒發(fā)酵添加迷迭香酸取代二氧化硫作為抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性干酵母：購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。沙棘果漿：北京匯源布爾津沙棘產(chǎn)業(yè)有限公司（新疆分公司）。8%迷迭香酸：河南佳尚農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。白砂糖、食用明膠均為市售食品級(jí)；果膠酶（5萬(wàn)U/g）：和氏壁生物技術(shù)有限公司。

二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、甲基紅、亞甲基藍(lán)等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

三聯(lián)體低溫發(fā)酵罐：實(shí)驗(yàn)室自制；1260型高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫公司；LXJ-IIB低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；752N型紫外可見分光光度計(jì)：上海電分析儀器有限公司；HFM-0530中空纖維膜過(guò)濾設(shè)備（過(guò)濾孔徑或截留分子量為100 kDa）：廈門福美科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果酒生產(chǎn)操作要點(diǎn)

（1）沙棘原漿的離心：稱取7.0 g明膠加入14 L果漿中，放入40℃烘箱中1 h，取出4 500 r/min離心10 min。

（2）發(fā)酵進(jìn)程的工藝控制：其中一個(gè)罐中不加抗氧化劑，另外兩個(gè)罐分別添加二氧化硫或迷迭香酸作為抗氧化劑。每罐白砂糖添加量為220 g/L，酵母添加量為0.2 g/L。

（3）控溫發(fā)酵：主發(fā)酵溫度控制為20℃，低溫發(fā)酵溫度控制為18℃。

（4）離心、過(guò)濾：發(fā)酵結(jié)束后4500r/min處理15min，得到清液后用截留100kDa分子質(zhì)量的中空纖維超濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

1.3.2 果酒理化指標(biāo)測(cè)定

（1）酒精度、總糖、還原糖、揮發(fā)酸、總二氧化硫和游離二氧化硫含量：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]進(jìn)行?？扇苄怨绦挝锖浚河檬殖痔橇坑?jì)測(cè)定；密度：用密度計(jì)測(cè)定。

（2）迷迭香酸含量測(cè)定：采用高效液相色譜儀測(cè)定，色譜條件為C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，4.6 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60，V/V）為流動(dòng)相，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，于波長(zhǎng)330 nm處進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 果酒抗氧化活性測(cè)定

按照文獻(xiàn)[12-13]，分別采用DPPH法、普魯士藍(lán)法和水楊酸法測(cè)定沙棘果酒清除DPPH自由基能力、還原力和清除羥自由基的能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)變化

經(jīng)離心的沙棘原漿分成3份，每份為3 L沙棘原漿加4 L水（調(diào)總酸（以酒石酸計(jì)）至6.0～6.5 g/L），加入220 g/L的白砂糖，0.2 g/L的酵母營(yíng)養(yǎng)劑，其中兩份分別加入750 mg/L的8%迷迭香酸粗品（相當(dāng)于60 mg/L迷迭香酸）、120 mg/L的偏重亞硫酸鉀（相當(dāng)于60 mg/L二氧化硫），另一份不添加抗氧化劑?；旌暇鶆蚝筮M(jìn)行發(fā)酵。沙棘發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)變化見表1。

表1 沙棘果酒發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)檢測(cè)Table 1 Index detection in the fermentation process of sea buckthorn fruit wine

由表1可知，發(fā)酵至第10天時(shí)，3個(gè)發(fā)酵罐中，可溶性固形物由23 g/L降至8 g/L，密度由1.08 g/L降至0.99 g/L；加入迷迭香酸與不加抗氧化劑的發(fā)酵罐中還原糖、總糖含量均＜5 g/L。而加入二氧化硫的發(fā)酵罐中，發(fā)酵5 d時(shí)還有11.88g/L還原糖，說(shuō)明二氧化硫?qū)湍赴l(fā)酵有一定的影響。

根據(jù)國(guó)標(biāo)要求酒精度為12%vol～24%vol，揮發(fā)酸≤1.1 g/L，游離二氧化硫≤20 mg/L，總二氧化硫≤250 mg/L，所以3種方式發(fā)酵得到的沙棘果酒均在國(guó)標(biāo)允許范圍內(nèi)。因此在沙棘果酒發(fā)酵時(shí)，添加迷迭香酸作為抗氧化劑替代二氧化硫，不會(huì)影響果酒發(fā)酵。

2.2 產(chǎn)品的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

（1）DPPH法測(cè)定沙棘果酒抗氧化活性

不同果酒對(duì)DPPH·的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，各果酒濃度與DPPH·清除能力之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，對(duì)比不加抗氧化劑與加二氧化硫和迷迭香酸作為抗氧化劑的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值可以發(fā)現(xiàn)，加迷迭香酸的IC50值最小，為8.02mg/mL。說(shuō)明迷迭香酸清除DPPH·能力較二氧化硫要好。

表2 不同濃度果酒對(duì)DPPH的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Effects of sea buckthorn fruit wine with different concentration on DPPH antioxidant capacity

（2）水楊酸法和普魯士藍(lán)法測(cè)定沙棘果酒抗氧化活性

分別取5個(gè)待測(cè)樣各2 mL，利用水楊酸法和普魯士藍(lán)法測(cè)定果酒中總抗氧化能力的大小，測(cè)定結(jié)果如表3。

表3 不同方式發(fā)酵沙棘果酒抗氧化性測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of antioxidant of sea buckthorn fruit wine with different fermentation methods

由表3可知，清除·OH的能力大小順序?yàn)椋好缘闼峁疲ㄇ宄?9.31%）＞無(wú)添加抗氧化劑果酒（清除率98.83%）＞二氧化硫果酒（清除率98.67%）；還原力大小順序?yàn)椋憾趸蚬疲久缘闼峁疲緹o(wú)添加抗氧化劑果酒。未添加抗氧化劑的沙棘果酒具有一定的羥自由基清除能力，分析原因是沙棘果酒原料中自身存在抗氧化劑成分，如維生素C、黃酮、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等。添加迷迭香酸的沙棘果酒具有較好的羥自由基清除能力及總還原力，迷迭香酸可以作為抗氧化劑替代二氧化硫進(jìn)行使用。

3 結(jié)論

結(jié)果表明在沙棘果酒發(fā)酵時(shí)，添加迷迭香酸作為抗氧化劑替代二氧化硫，不會(huì)影響果酒發(fā)酵。

3種方式發(fā)酵果酒清除DPPH·的能力大小順序?yàn)槊缘闼峁疲↖C50=8.02 mg/mL）＞二氧化硫果酒（IC50=10.31 mg/mL）＞無(wú)添加抗氧化劑果酒（IC50=11.47 mg/mL）；清除·OH能力大小順序?yàn)槊缘闼峁疲ㄇ宄?9.31%）＞無(wú)添加抗氧化劑果酒（清除率98.83%）＞二氧化硫果酒（清除率98.67%）；還原力大小順序?yàn)槎趸蚬?迷迭香酸果酒＞無(wú)添加抗氧化劑果酒。迷迭香酸可以替代二氧化硫作為抗氧化劑進(jìn)行果酒釀造，從而避免二氧化硫?qū)θ祟惤】荡嬖诘挠绊憽?/p>