滿都拉，劉 昊，鄭逸飛，孫子羽，陳忠軍*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

小曲是中國傳統(tǒng)酒曲的一種[1]，是釀造小曲白酒和黃酒的重要糖化劑和發(fā)酵劑[2]。小曲一般是以米粉、米糠或麩皮為原料，會添加一些中草藥或少量白土（觀音土），接種曲母或純培養(yǎng)的根霉、酵母菌，加入適量水制成曲丸或方粒，經(jīng)人工控制溫度、濕度等條件培養(yǎng)而成的干燥物[3-4]。由于曲塊個體較小，人們習慣上稱為小曲[4]。不同地區(qū)叫法略有不同，如白藥、白曲、酒藥、酒餅、糠曲、藥曲、酒曲丸等[5]。

小曲中包含大量的微生物和酶類，一般認為主要由酵母菌、霉菌和細菌組成[6]。雖然細菌在小曲中數(shù)量較少，但發(fā)揮著不可替代的作用。不同種類的細菌對小曲酒的品質有不同的影響，一些細菌會產(chǎn)生淀粉酶、酯化酶等，對出酒率和酒的風味有重要影響[7]，一些細菌代謝產(chǎn)生酸類、醛類等物質，對小曲酒香型的呈現(xiàn)和品格的提升具有重要意義[8]。小曲中添加的不同中草藥對曲中微生物有重要影響。有研究表明[9]較添加桑葉和辣蓼，桂皮小曲中細菌總數(shù)最低。翟平平等[10-11]利用分子生物學手段分析某地小曲后發(fā)現(xiàn)，小曲中主要微生物類群為乳酸菌屬（Lactobacillus sp.），此外還有黃單胞菌屬（Xanthornonas sp.）、沙雷氏菌屬（Serratia sp.）、木崎氏菌屬（Kozakia）及片球菌屬（Pediococcus）等菌屬。

不同氣候條件和不同原料等對小曲中微生物組成都有重要的影響。本研究以湖北、安徽和四川3個地區(qū)的小曲為研究對象，采傳統(tǒng)培養(yǎng)方法及分子生物學方法，分離和鑒定其中可培養(yǎng)細菌，為進一步研究小曲酒風味形成及改良小曲奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 小曲

小曲：采自湖北宜昌（樣品A）、安徽亳州（樣品B）和四川達州（樣品C）。小曲形態(tài)及主要原料如表1所示。

表1 小曲形態(tài)及主要原料Table 1 Morphology and main raw materials of Xiaoqu

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉2.5 g，氯化鈉5.0g，加入蒸餾水500mL，調pH值7.2后加7.5 g瓊脂，121℃、20 min高壓滅菌。

1.1.3 化學試劑

革蘭仕染色試劑盒：廣州凱元生物科技有限公司；NaOH、HCl、體積分數(shù)為75%乙醇、胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂、瓊脂糖等均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

DYCP-31BN型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海精密科學儀器有限公司；S1000美國伯樂聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；PHB-1/PHB-10pH計：上海精賢光電科技有限公司；DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱：品相科儀（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小曲中可培養(yǎng)細菌的分離

利用體積分數(shù)為75%乙醇對小曲表面進行滅菌后，中心部分用研缽輕微研磨，取1.0 g溶于100 mL無菌水，振蕩1～2 min，靜置5 min后，待用。吸取上步1 mL菌液進行梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5各0.1 mL涂布于培養(yǎng)皿，30 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)及顏色不同的單一菌落進行劃線純化，每個單菌落純化3次。鏡檢：格蘭氏染色后進行鏡檢。

1.3.2 小曲中可培養(yǎng)細菌的分子生物學鑒定

基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取：采取反復凍融法提取基因組DNA，在2 mL離心管中加入1 mL無菌水，挑取單一菌落混勻，-80℃冷凍20 min，取出后立即置于90℃水浴20 min，反復操作3次。

16S rDNA擴增及瓊脂糖電泳：利用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，PCR擴增條件為94℃預變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min（循環(huán)30次）；72℃再延伸1.0 min。取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混合后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

PCR產(chǎn)物測序：由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

同源性比較：登錄美國國家生物技術信息中心（national centerof biotechnology information，NCBI），將所得的基因序列用基本地方調整搜尋工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比較，系統(tǒng)發(fā)育樹利用Mega 7中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建。

1.3.3 分析檢測

pH的測定：用研缽將樣品粉碎，稱取10.0 g溶于100 mL蒸餾水，振蕩搖勻，靜置30 min后，用pH計測定pH值；含水量測定：失重法；密度測定：排水法。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)小曲pH、含水量及密度

不同地區(qū)小曲pH、含水量及密度測定結果見表2。由表2可知，安徽和四川的小曲pH相近（5.35～5.60），而湖北小曲的pH略微偏低，這可能與3種小曲的制作原料及所含微生物不同有關。安徽小曲的含水量（12.33%）明顯高于四川小曲（9.41%）和安徽小曲（9.93%），這可能與安徽的氣候條件及保藏方式有關。3種小曲的密度差異較?。?.84～0.92 g/mL）。

表2 不同地區(qū)小曲pH、含水量及密度測定結果Table 2 Determination results of pH,moisture and density of Xiaoqu from different regions

2.2 不同地區(qū)小曲中可培養(yǎng)細菌的分離及鑒定

2.2.1 湖北小曲中可培養(yǎng)細菌的分離及鑒定

湖北小曲中共分離出8株可培養(yǎng)細菌，細胞形態(tài)及菌落形態(tài)如表3所示。由表3可知，湖北小曲中分離的8株可培養(yǎng)細菌均為桿狀、革蘭氏陽性菌。

經(jīng)基因組提取、PCR擴增及電泳，湖北小曲中可培養(yǎng)細菌16S rDNA擴增結果如圖1所示。由圖1可知，PCR擴增產(chǎn)物的長度在1 000～2 000 bp之間，符合所選引物擴增長度。PCR產(chǎn)物測序及同源性比對結果如圖2所示。由圖2可知，湖北小曲中分離得到的可培養(yǎng)細菌中有6株鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），1株鑒定為泛菌屬（Pantoea spp.），1株鑒定為豐年芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）。湖北小曲可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)進化樹中有3個大簇。第一大簇中菌株XQA-3B、XQA-3C、XQA-5C、XQA-5A、XQA-5B和XQA-3D與枯草芽孢桿菌同源性均為100%；第二大簇中只有一株XQA-4A，其與B.toyonensis同源性為100%；第三大簇中菌株XQA-3A與泛菌屬同源性為100%。

表3 湖北小曲可培養(yǎng)細菌細胞及菌落形態(tài)Table 3 Cell and colony morphology of the cultureable bacteria in Hubei Xiaoqu

圖1 湖北小曲可培養(yǎng)細菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物結果Fig.1 PCR amplification products results of 16S rDNA of the culturable bacteria in Hubei Xiaoqu

圖2 湖北小曲可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the culturable bacteria in Hubei Xiaoqu

2.2.2 安徽小曲中可培養(yǎng)細菌的分離及鑒定

安徽小曲中共分離出5株可培養(yǎng)細菌，細胞及菌落形態(tài)見表4。由表4可知，分離得到的5株細菌均為桿狀，革蘭氏陽性菌。

表4 安徽小曲可培養(yǎng)細菌細胞及菌落形態(tài)Table 4 Cell and colony morphology of the cultureable bacteria in Anhui Xiaoqu

續(xù)表

經(jīng)基因組DNA提取及PCR擴增，安徽小曲中可培養(yǎng)細菌16S rDNA擴增結果如圖3所示。由圖3可知，PCR擴增產(chǎn)物長度在1 000～2 000 bp之間，符合目的片段長度。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序及同源性比對結果見圖4。由圖4可知，安徽小曲中分離得到的可培養(yǎng)細菌中3株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），1株為埃希氏菌屬（Escherichia spp.），1株為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。安徽小曲可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)進化樹中有2個大簇，第一大簇又分為兩個小簇。菌株XQB-4A、XQB-4E和XQB-4C與植物芽孢桿菌的同源性均為100%；菌株XQB-3A與枯草芽孢桿菌同源性為100%；菌株XQB-5B與埃希氏菌屬同源性為100%。

圖3 安徽小曲可培養(yǎng)細菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物結果Fig.3 PCR amplification products results of 16S rDNA of the culturable bacteria in Anhui Xiaoqu

圖4 安徽小曲可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the culturable bacteria in Anhui Xiaoqu

2.2.3 四川小曲中可培養(yǎng)細菌的分離及鑒定

四川小曲中共分離出7株可培養(yǎng)細菌，細胞形態(tài)及菌落形態(tài)見表5。由表5可知，7株細菌均為桿狀，革蘭氏陽性菌。

表5 四川小曲可培養(yǎng)細菌細胞及菌落形態(tài)Table 5 Cell and colony morphology of the cultureable bacteria in Sichuan Xiaoqu

經(jīng)基因組DNA提取及PCR擴增，四川小曲中可培養(yǎng)細菌16S rDNA擴增結果如圖5所示。由圖5可知，PCR擴增產(chǎn)物長度在1 000～2 000 bp之間，符合目的片段長度。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序及同源性比對，結果見圖6。由圖6可知，四川小曲中分離的可培養(yǎng)細菌分別為2株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），1株豐年芽孢桿菌（Bacillus toyonensis），1株普城沙雷氏桿菌（Serratia plymuthica），1株炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis），1株蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）及1株Burkholderia fungorum。四川小曲中可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)進化樹中主要有3個大簇。第一個大簇中的菌株XQC-4C、XQC-A1和XQC-4B分別與蠟狀芽孢桿菌、B.toyonensis和炭疽芽孢桿菌的同源性為100%。第二大簇中的菌株XQC-4D和XQC-D2與枯草芽孢桿菌同源性為100%。第三大簇中菌株XQC-E1與普城沙雷氏桿菌的同源性為75%，而菌株XQC-4A與B.fungorum同源性達到100%。

圖5 四川小曲可培養(yǎng)細菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物結果Fig.5 PCR amplification products results of 16S rDNA of the culturable bacteria in Sichuan Xiaoqu

圖6 四川小曲可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of the culturable bacteria in Sichuan Xiaoqu

2.3 討論

本研究中3種小曲內(nèi)可培養(yǎng)細菌主要以芽孢桿菌為主，其中包括枯草芽孢桿菌、B.toyonensis、蠟狀芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌等。3種小曲中均有枯草芽孢桿菌，此類菌在土壤和植物表面普遍存在，易于存活，可分泌出多種酶和抗生素，有良好的發(fā)酵基礎。湖北小曲中發(fā)現(xiàn)了泛菌屬，此類菌一般存在于植物中，可能由制作原料帶入。它在釀造過程中沒有提升酒的產(chǎn)量或質量的作用，且其自身的生長代謝會消耗一定的營養(yǎng)物質[12]。泛菌屬在發(fā)酵過程中，會發(fā)酵糖類產(chǎn)酸，應該適當減少小曲中泛菌屬的數(shù)量，以防影響酒的質量。在四川小曲中發(fā)現(xiàn)了B.fungorum，李浩等[13]在構建該種細菌的分批發(fā)酵動力學模型時指出B.fungorum有較好的葡萄糖發(fā)酵能力。同時在四川小曲中還發(fā)現(xiàn)了蠟狀芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌對單糖的利用率較高。炭疽芽胞桿菌的氨基酸降解和轉運途徑較豐富[14]，對酒產(chǎn)品的發(fā)酵起一定的促進作用。有關分子生物學研究顯示，小曲中的主要細菌類群以乳酸菌屬為主[10-11，15]，而在本研究中只有在安徽小曲中分離出了乳酸菌屬。這可能由兩方面原因造成，一是所用分離培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，不是乳酸菌屬適合的培養(yǎng)基。其次是在初篩的過程中由形態(tài)特征不明顯，誤認為同一株菌而被淘汰。

3 結論

不同原料、不同氣候條件對小曲中可培養(yǎng)細菌種類有很大的影響。芽孢桿菌為小曲中主要可培養(yǎng)細菌，其中枯草芽孢桿菌為最常見。湖北小曲中發(fā)現(xiàn)的泛菌屬可發(fā)酵糖類產(chǎn)酸，會影響酒產(chǎn)品的質量，適當減少小曲中泛菌屬的數(shù)量有利于提高小曲酒的品質。在安徽小曲中發(fā)現(xiàn)的植物乳桿菌，它在發(fā)酵過程中，對食品的風味和質量有著重要的影響，埃希氏菌屬中部分菌種對發(fā)酵有利，但部分菌種可致病，因此在生產(chǎn)過程中要注意致病菌。四川小曲中發(fā)現(xiàn)了Burkholderia fungorum、蠟狀芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌，這3種菌對發(fā)酵都有一定促進作用，但某些炭疽芽孢桿菌是致病菌應予以注意。