韋云路，李 璐，李全宏*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

南瓜（Cucurbita spp.）屬葫蘆科南瓜屬，一年生草本植物[1]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有多種保健和藥用功效。南瓜果實(shí)中不僅含有多糖、果膠、纖維素等碳水化合物類，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)南瓜提取物還可作為藥材[2]。研究表明，南瓜具有抗氧化、抗腫瘤[3]、保肝護(hù)肝[4]、降血脂[5]、調(diào)節(jié)免疫[6]和改善Ⅱ型糖尿病[7]等益生作用。在我國(guó)廣泛種植栽培南瓜的大背景下，南瓜的綜合利用尚不完善，主要作為蔬菜以鮮食為主，通過(guò)深加工技術(shù)開(kāi)發(fā)多種南瓜產(chǎn)品以提高南瓜的附加值，其市場(chǎng)及產(chǎn)業(yè)化前景更加廣闊[8-9]，因此，研究開(kāi)發(fā)新型的南瓜功能性食品有利于南瓜資源的開(kāi)發(fā)利用。隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品的要求也不僅只停留在解決溫飽，而是更加注重其營(yíng)養(yǎng)和保健功效。以果蔬為原料開(kāi)發(fā)的果蔬醋大多數(shù)都果香、醋香濃郁，營(yíng)養(yǎng)豐富、酸甜可口[10]，加以利用復(fù)合菌株在發(fā)酵過(guò)程中的相互協(xié)作，通過(guò)微生物代謝途徑產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生既能夠保留原料的營(yíng)養(yǎng)成分和香氣成分，又兼具有保健功能的果醋產(chǎn)品，具有廣闊的消費(fèi)市場(chǎng)和開(kāi)發(fā)前景[11]。VIANA RO等[12]研究以開(kāi)菲爾菌種釀造蘋(píng)果醋，發(fā)現(xiàn)開(kāi)菲爾蘋(píng)果醋中有機(jī)酸種類和含量豐富，且含有多種微生物，經(jīng)鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）和Acetobacter syzygii。李迎楠[13]采用復(fù)合菌株發(fā)酵酸漿果醋并研究其活性成分，發(fā)現(xiàn)得到的酸漿果醋口感柔和，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，總酸含量可達(dá)51 g/L，含有多種氨基酸和有機(jī)酸，同時(shí)含有1.31 mg/mL胡蘿卜素。吳茂玉等[14]在蘋(píng)果醋釀造過(guò)程中采用增香酵母和乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，制得的果醋飲料澄清透明，光澤度好，且具有蘋(píng)果特有的果香。

本研究開(kāi)發(fā)了一種新型的復(fù)合菌株發(fā)酵南瓜醋飲料，以南瓜為原料，將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）滬釀1.01與嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）復(fù)合菌株以一定的比例接種于經(jīng)過(guò)復(fù)合酶處理的南瓜漿中進(jìn)行發(fā)酵，酵母菌可以首先分解利用果蔬原料中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)代謝碳水化合物產(chǎn)生乙醇；而通過(guò)醋酸菌的作用，可進(jìn)一步將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸；加上嗜酸乳桿菌可以代謝乙酸和部分有機(jī)酸生成風(fēng)味較為柔和的乳酸，積累豐富的有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物[13]，從而制得既具有南瓜保健成分，又香氣濃郁、口感醇厚的南瓜醋產(chǎn)品[15]。果醋類產(chǎn)品對(duì)澄清度要求較高，因此本研究考察澄清劑種類、澄清劑復(fù)配比例以及澄清溫度和時(shí)間對(duì)南瓜醋的澄清效果的影響，并通過(guò)單因素和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化南瓜醋的澄清工藝條件，并考察南瓜醋的抗氧化能力，以期為新型發(fā)酵南瓜醋的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料及菌株

新鮮南瓜：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）滬釀1.01、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

1.1.2 化學(xué)試劑

β-葡聚糖酶（10萬(wàn)U/g）：山東欣鼎生物科技有限公司；糖化酶（5萬(wàn)U/g）：多味化工食品有限公司；纖維素酶（2萬(wàn)U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；果膠酶（5萬(wàn)U/g）：和氏璧生物科技有限公司；明膠、殼聚糖、硅藻土和羧甲基纖維素鈉（均為食品級(jí)）：鄭州安安康食品原料有限公司；皂土（食品級(jí)）：煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：北京化工廠；總抗氧化能力測(cè)試盒、抑制羥自由基試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽浸粉肉湯（malt extract broth，MEB）培養(yǎng)基：麥芽浸粉 20 g/L，pH調(diào)至6.9±0.2，121℃滅菌15 min。用于酵母菌的培養(yǎng)。

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，硫酸鎂0.1 g/L，醋酸鈉5.0g/L，檸檬酸銨2.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，吐溫80 1.0 mL/L，硫酸錳0.05 g/L，pH調(diào)至6.9±0.2，121℃滅菌15 min。用于乳酸菌的培養(yǎng)。

醋桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母提取物10 g/L，121℃高壓滅菌15min，臨用前加4%過(guò)濾除菌的無(wú)水乙醇。

1.2 設(shè)備與儀器

JYZ-E91九陽(yáng)料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：天津科諾儀器設(shè)備有限公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16A臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司：UV-2802紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：尤尼科（上海）儀器有限公司；imark酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio Rad公司；HZQ-F160全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)市豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合菌株發(fā)酵南瓜醋的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

南瓜漿的制備：新鮮南瓜洗凈、去皮、切塊，將南瓜塊與蒸餾水按照1∶3（g∶mL）置于料理機(jī)中打漿，得到新鮮的南瓜漿。

酶解：采用由糖化酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶（1∶1∶1∶1）組成的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，總酶添加量為0.4 g/L，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間50 min，沸水浴10 min滅酶。

殺菌、冷卻：酶解南瓜漿121℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至室溫后備用。

接種發(fā)酵：按總接種量10%，復(fù)合菌種接種比例（釀酒酵母/巴氏醋桿菌滬釀1.01/嗜酸乳桿菌1∶2∶2），先向南瓜漿中接種2%釀酒酵母菌，30℃培養(yǎng)2 d，再向其中接種4%巴氏醋桿菌滬釀1.01，30℃培養(yǎng)3 d，最后接種4%嗜酸乳桿菌，30℃培養(yǎng)2 d，結(jié)束發(fā)酵。

澄清：考察澄清劑種類、復(fù)配比例、靜置溫度和靜置時(shí)間對(duì)南瓜醋的影響，優(yōu)化澄清工藝，得到南瓜醋成品。

1.3.2 單一澄清劑的篩選

將配制的1%明膠溶液、硅藻土懸浮液、殼聚糖溶液、羧甲基纖維素鈉溶液及皂土懸浮液分別以1%、2%、3%、4%、5%加入等量的復(fù)合菌株在最佳工藝條件下發(fā)酵的南瓜醋中，25℃靜置12 h，離心（8 000 r/min、10 min）、過(guò)濾，取上清液測(cè)定透光率，每組做3次平行試驗(yàn)，選取效果最佳的澄清劑及其最適的添加比例。

1.3.3 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

根據(jù)單一澄清劑的篩選試驗(yàn)結(jié)果，選取兩種效果較好的澄清劑進(jìn)行復(fù)配，復(fù)合澄清劑添加量4%，并探究殼聚糖和明膠體積比（1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、1∶1）、靜置溫度（5 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45℃）和靜置時(shí)間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）對(duì)澄清效果的影響。

1.3.4 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，復(fù)合澄清劑添加量4%，以復(fù)配比例（A）、靜置溫度（B）和靜置時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。使用Minitab 16軟件，以透光率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)，確定復(fù)配澄清劑澄清南瓜醋的最佳澄清工藝條件。

1.3.5 分析檢測(cè)

澄清度的測(cè)定：取澄清后的南瓜醋，經(jīng)離心和過(guò)濾后，取清液，在波長(zhǎng)650 nm條件下，以蒸餾水為參比，測(cè)定清液的吸光度值A(chǔ)，計(jì)算溶液的透光率T，計(jì)算公式為T(mén)＝10-A?？偹岷康臏y(cè)定：采用酸堿滴定法；有機(jī)酸測(cè)定：乳酸、丁二酸（琥珀酸）、檸檬酸、酒石酸和富馬酸含量的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB 5009.157—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品有機(jī)酸的測(cè)定》，乙酸和草酸的測(cè)定采用離子色譜法；抗氧化活性測(cè)定：總抗氧化能力測(cè)定采用總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測(cè)定試劑盒、羥自由基清除能力采用羥自由基測(cè)定試劑盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一澄清劑的篩選

圖1 不同澄清劑對(duì)南瓜醋的澄清效果Fig.1 Effect of different clarifying agents on clarification effect of pumpkin vinegar

由圖1可知，5種澄清劑中殼聚糖和明膠的澄清效果較好，在添加量相對(duì)較小的情況下，澄清樣品也具有較高的透光率。殼聚糖較優(yōu)的添加量為2%，此時(shí)南瓜醋透光率為89.3%，明膠較優(yōu)的添加量為4%，此時(shí)南瓜醋的透光率為92.1%。其余幾種澄清劑雖然澄清效果與這兩種相差不大，但是添加量間相對(duì)較大，可能會(huì)對(duì)南瓜醋的風(fēng)味等產(chǎn)生較多不良影響，因此，選擇殼聚糖和明膠兩種澄清劑復(fù)配進(jìn)一步探究南瓜醋澄清工藝。

2.2 復(fù)配比例對(duì)澄清效果的影響

由圖2可知，隨著殼聚糖和明膠體積比的變化，透光率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，殼聚糖和明膠體積比為1∶5～2∶5時(shí)，透光率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；在殼聚糖和明膠體積比為2∶5時(shí)，澄清效果最佳，透光率達(dá)到97.1%；殼聚糖和明膠體積比為2∶5～1∶1時(shí)，透光率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡苡捎跉ぞ厶呛兔髂z體積比為2∶5左右時(shí)，澄清劑引起的絮凝效果最佳，復(fù)配帶來(lái)的“架橋”作用達(dá)到最佳的效果[16]。因此，殼聚糖和明膠最佳體積比為2∶5。

圖2 殼聚糖和明膠體積比對(duì)澄清效果的影響Fig.2 Effect of volume ratio of chitosan to gelatin on clarification effect

2.3 靜置溫度對(duì)澄清效果的影響

圖3 靜置溫度對(duì)澄清效果的影響Fig.3 Effect of standing temperature on clarification effect

由圖3可知，隨著靜置溫度在5～45℃范圍內(nèi)升高，透光率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，靜置溫度在5～25℃范圍內(nèi)升高，透光率呈現(xiàn)先上升趨勢(shì)；靜置溫度為25℃時(shí)為最佳，透光率可達(dá)95.3%；靜置溫度高于25℃之后，透光率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳靜置溫度為25℃。

2.4 靜置時(shí)間對(duì)澄清效果的影響

圖4 靜置時(shí)間對(duì)澄清效果的影響Fig.4 Effect of standing time on clarification effect

由圖4可知，透光率隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先略微上升后下降趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，靜置時(shí)間在2～4 h時(shí)，透光率隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；靜置時(shí)間為4 h時(shí)，透光率達(dá)到最高，為94.5%左右；靜置時(shí)間＞4 h之后，透光率隨著靜置時(shí)間而下降。因此，選擇最佳靜置時(shí)間為4 h。

2.5 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇殼聚糖和明膠體積比、靜置溫度和靜置時(shí)間3個(gè)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析見(jiàn)表1。

表1 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for clarification technology optimization of pumpkin vinegar

由表1可知，根據(jù)R值大小，得出因素影響的主次順序RB＞RC＞RA，靜置溫度＞靜置時(shí)間＞殼聚糖和明膠體積比。正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A1B2C2，即殼聚糖和明膠比例1∶5，靜置溫度25℃，靜置時(shí)間4 h。在此優(yōu)化澄清工藝條件下，其透光率可達(dá)（93.1±1.2）%。

2.6 產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定分析

2.6.1 南瓜醋與南瓜漿中總酸和有機(jī)酸組成

表2 南瓜醋與南瓜漿中有機(jī)酸種類及含量Table 2 Types and contents of organic acids in pumpkin vinegar and pumpkin pulp g/L

由表2可知，南瓜醋總酸含量為52.1 g/L，達(dá)到農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 2987—2016《綠色食品果醋飲料》中規(guī)定的總酸含量標(biāo)準(zhǔn)（≥3 g/kg）。與酶解南瓜漿相比，南瓜醋中有機(jī)酸的種類和含量整體都有不同程度的改變，這可能是由于發(fā)酵過(guò)程中，原料中的部分有機(jī)酸被釀酒酵母、醋桿菌和嗜酸乳桿菌等微生物利用生成新的有機(jī)酸[17]。如酒石酸在乳酸菌作用下可能降解為乳酸和乙酸，釀酒酵母作用于果蔬汁會(huì)生成一些檸檬酸，但檸檬酸又容易在乳酸菌的作用下被大量消耗生成醋酸[18]。琥珀酸絕大部分源于酒精發(fā)酵過(guò)程中糖類物質(zhì)發(fā)酵后的產(chǎn)物。

有機(jī)酸的含量及其各自獨(dú)特的味道是構(gòu)成果醋獨(dú)特酸味味感的主要因素[19]。琥珀酸鮮味比較突出，蘋(píng)果酸清爽稍帶濕味，這些有機(jī)酸的味道可以調(diào)節(jié)乙酸強(qiáng)烈的刺激，從而使果醋的酸味更加平和、醇厚。復(fù)合菌株發(fā)酵得到的南瓜果醋有機(jī)酸種類豐富，其中乙酸和乳酸含量最高，草酸也可作為主體有機(jī)酸的一部分，另外還含有檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等。醋的酸味質(zhì)量、緩沖性及酸度與有機(jī)酸的種類、含量組成和相互比例有直接關(guān)系，乙酸口感上刺激性較大，乳酸相對(duì)口感醇厚柔和；琥珀酸鮮味比較突出，但了略帶香味可以緩沖乙酸的刺激性。有機(jī)酸含量取決于發(fā)酵原料的糖和稀釋乙醇的濃度，與其特有的味道構(gòu)成果醋獨(dú)特的味感。

2.6.2 南瓜醋的抗氧化能力

圖5 不同種類醋樣品的總抗氧化能力（A）及抑制羥自由基能力（B）Fig.5 Total antioxidant capability(A)and hydroxyl radicals scavenging capability(B)of different kinds of vinegar samples

食醋產(chǎn)品都具有一定的抗氧化能力，將南瓜醋與市售的米醋、蘋(píng)果醋的總抗氧化能力和抑制羥自由基的能力進(jìn)行了比較。由圖5可知，南瓜醋的總抗氧化能力（1.3 U/mL）和羥基自由基清除能力（71%）低于蘋(píng)果醋，但高于市售的米醋?？赡苁怯捎诎l(fā)酵底物不同，發(fā)酵液中的抗氧化物的種類和含量不同，導(dǎo)致了各種食醋的抗氧化能力有一定的差異。孫璐宏等[20]研究柿果醋生產(chǎn)過(guò)程中抗氧化性能變化，發(fā)現(xiàn)柿果醋對(duì)DPPH自由基的清除能力在陳釀結(jié)束時(shí)可達(dá)到51.89%；王志煌[21]以椰棗為原料制作果醋，當(dāng)濃度為8%時(shí)，椰棗果醋對(duì)DPPH自由基的清除達(dá)到97%；此外，市售的食醋大多經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的澄清殺菌等工藝，也會(huì)造成一些抗氧化物質(zhì)的損失。

3 結(jié)論

本研究以復(fù)合菌株發(fā)酵南瓜醋，選擇釀酒酵母、巴氏醋桿菌滬釀1.01和嗜酸乳桿菌3種菌株，以殼聚糖和明膠復(fù)配比例、靜置溫度和靜置時(shí)間為探究因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化澄清工藝參數(shù)。結(jié)果表明，最佳澄清工藝條件為殼聚糖和明膠體積比1∶5，靜置溫度25℃，靜置時(shí)間4 h。在此優(yōu)化條件下，南瓜醋透光率為（93.1±1.2）%。制得的南瓜醋產(chǎn)品總酸含量52.1 g/L，包含豐富的有機(jī)酸種類，其中乙酸和乳酸含量最高，分別為3.0 g/L和0.49 g/L，總抗氧化能力和羥基自由基清除率分別可達(dá)1.3 U/mL、71%，表現(xiàn)出了良好的體外抗氧化活性，且表現(xiàn)出了良好的體外抗氧化活性。