胡欣穎 賀稚非 李洪軍

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

隨著食品行業(yè)的發(fā)展，食品分析技術(shù)的作用日趨重要。應(yīng)用化學(xué)分析方法，如原子吸收光譜法(atomic absorption spectroscopy，AAS)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)以及各種聯(lián)用方法如氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等，檢測食品中有毒有害物質(zhì)，但前處理過程繁雜、需要專業(yè)操作人員、分析步驟繁瑣、設(shè)備昂貴[1-2]，并且受限于實驗室使用，無法在食品生產(chǎn)與流通過程中實現(xiàn)有毒有害物質(zhì)的實時檢測。最主要的是這些技術(shù)雖然能檢測化合物濃度，但不能反映有關(guān)樣品的毒性[3]。生物學(xué)檢測方法不僅可以估計樣本毒性，還可以估計毒物對整個生態(tài)系統(tǒng)的綜合影響[4]。經(jīng)典生物測定通常使用小鼠、魚類、藻類、甲殼類動物、植物或其他生物體[5]，但也存在缺點：需要特殊設(shè)備和專業(yè)操作人員，測定時間長、重現(xiàn)性低以及存在生物標(biāo)準(zhǔn)化爭議[5-7]。因此尋找一種簡單、快速且便宜的生物檢測方法成為迫切的需求。

發(fā)光細(xì)菌是一類在正常代謝過程會發(fā)光的生物。自1969年Kossler闡述了基于生物發(fā)光細(xì)菌的生物測定法后[8]，發(fā)光細(xì)菌逐漸被用于各種環(huán)境污染物監(jiān)測和食品單一及綜合毒性評價。同時構(gòu)建了以發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強度變化為指標(biāo)的有害物質(zhì)檢測標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的檢測試劑盒也陸續(xù)研制成功[9]。相較于化學(xué)檢測，發(fā)光細(xì)菌檢測具有前處理簡單，反應(yīng)快、靈敏度高、可實時監(jiān)測，成本低、樣品需求量少、實驗室及耗材需求低等優(yōu)點[10-11]，將成為食品安全檢測新的發(fā)展方向，目前中國關(guān)于發(fā)光細(xì)菌檢測的研究相對較少，缺乏對發(fā)光細(xì)菌在毒性評估和食品有毒有害物質(zhì)檢測方面的系統(tǒng)性分析和總結(jié)。

基于此，本文綜述發(fā)光細(xì)菌在毒性評估及食品安全檢測中的應(yīng)用，對發(fā)光細(xì)菌檢測存在的問題及未來的發(fā)展方向進行分析和總結(jié)，以期對發(fā)光細(xì)菌在食品有毒有害物質(zhì)檢測中的應(yīng)用和新型檢測儀器的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 發(fā)光細(xì)菌檢測有毒有害物質(zhì)的機理

1.1 發(fā)光細(xì)菌簡介

生物發(fā)光是一種常見的現(xiàn)象，絕大多數(shù)生物發(fā)光有機體生活在海洋中，只有少數(shù)生活在陸地或淡水環(huán)境中。發(fā)光細(xì)菌是一類能夠在正常代謝過程中發(fā)出藍(lán)綠色光的生物，全部是革蘭氏陰性菌，其大多為直桿菌，也有少數(shù)呈弧狀或球桿狀，有鞭毛。發(fā)光細(xì)菌個體微小，長度約為1.5～3.0 μm，寬度約為0.5～0.8 μm，釋放的藍(lán)綠色熒光波長范圍為450～490 nm[12]。單個發(fā)光細(xì)菌發(fā)出的光極其微弱，肉眼幾乎不可見，但當(dāng)大量發(fā)光細(xì)菌聚集在一起時，發(fā)出的光則肉眼可見。

發(fā)光細(xì)菌屬于變形菌門、γ變形菌綱。發(fā)光細(xì)菌可分為4個屬：光桿菌屬(Phototrhabdus)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和弧菌屬(Vibrio)[12-13]。光桿菌屬的典型菌有陸地發(fā)光桿菌(P.luminescens)、溫和光桿菌(P.temperate)等，發(fā)光桿菌屬的典型菌有明亮發(fā)光桿菌(P.phosphoreum)、鰒魚發(fā)光桿菌(P.leiognathi)、夾孢發(fā)光桿菌(P.angustum)等，希瓦氏菌屬的典型菌有羽田希瓦氏菌(S.hanedai)等，弧菌屬的典型菌有哈維氏弧菌(V.harveyi)、費氏弧菌(V.fischeri)、青?；【?V.qinghaiensis)、霍亂弧菌(V.cholerae)等。

1.2 發(fā)光細(xì)菌檢測機理

發(fā)光細(xì)菌中分子氧以還原態(tài)的黃素單核苷酸(FMNH2)及長鏈脂肪醛(RCHO)為底物，經(jīng)胞內(nèi)細(xì)菌熒光酶催化作用，將二者分別氧化為黃素核苷酸(FMN)和長鏈脂肪酸，同時伴隨著波長為450～490 nm藍(lán)綠光的釋放，可以通過生物發(fā)光計檢測。

在發(fā)光細(xì)菌中廣泛存在表達熒光素基因(lux)。lux基因主要包括luxC、luxD、luxA、luxB、luxE 5個部分，其中l(wèi)uxA、luxB編碼熒光素酶[14]，該酶是一種分子量為80 kDa的異二聚體蛋白，包括α(40～42 kDa)和β(36～37.5 kDa)2個亞基[15]，在其發(fā)光過程對FMNH2具有高度的特異性。luxC、luxD、luxE分別編碼酰基蛋白還原酶(R，54 kDa)、酰基轉(zhuǎn)移酶(t，33 kDa)和依賴ATP的合成酶(S，42 kDa)，這3種酶能夠組成脂肪酸還原酶復(fù)合體催化醛類(該反應(yīng)中參與發(fā)光的醛可能是十四醛)生成，使細(xì)菌持續(xù)發(fā)光[16]。海洋發(fā)光細(xì)菌，如明亮發(fā)光桿菌(P.phosphoreum)、鰒魚發(fā)光桿菌(P.leiognathi)、哈維氏菌(V.harveyi)、費氏弧菌(V.fischeri)等，在luxE之后還有一個額外的基因luxG，有研究者[17]推測luxG基因產(chǎn)物是為螢光素酶反應(yīng)提供FMNH-底物的黃素還原酶。發(fā)光細(xì)菌生物發(fā)光機理見圖1[9]。

圖1 發(fā)光細(xì)菌生物發(fā)光機理Figure 1 Luminescent bacteria bioluminescence mechanism

發(fā)光細(xì)菌檢測機理分為特異性檢測和非特異性檢測，特異性發(fā)光細(xì)菌檢測是根據(jù)受體-報告基因的原理(“l(fā)ights on”模式)[18]，在lux上游導(dǎo)入特殊應(yīng)激啟動子，當(dāng)宿主細(xì)胞的生長環(huán)境中有毒物存在時，毒物進入到宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性調(diào)控元件，進而調(diào)控下游基因表達，發(fā)出光源。非特異性檢測利用的原理是發(fā)光細(xì)菌“l(fā)ights off”模式[19-20]，即外來毒物通過直接抑制發(fā)光細(xì)菌酶的活性以及抑制細(xì)胞內(nèi)有關(guān)發(fā)光反應(yīng)的生理代謝對發(fā)光細(xì)菌形成發(fā)光抑制作用，見圖2[19]。在“l(fā)ights on”測定中，可定量的報道分子與已知的被測目標(biāo)毒物活化的特定基因啟動子融合，改變發(fā)光強度。在“l(fā)ights off”測定中，樣品毒性根據(jù)正常細(xì)胞活性的抑制程度估算，這種抑制可以發(fā)生在反應(yīng)的任何階段或影響細(xì)胞生長發(fā)育的任何位點。生物發(fā)光廣泛依賴于細(xì)胞代謝，需要高能輔因子，因此，當(dāng)接觸到外界有毒有害物質(zhì)時，發(fā)光細(xì)菌新陳代謝受到影響，進而使發(fā)光強度減小[21-22]。

圖2 發(fā)光細(xì)菌檢測有害物質(zhì)原理Figure 2 The principle of detecting harmful substances by luminescent bacteria

2 發(fā)光細(xì)菌在毒性評估中的研究現(xiàn)狀

2.1 利用發(fā)光細(xì)菌檢測與傳統(tǒng)急性毒性檢測方法對比

生物毒性是指外源性物質(zhì)與機體接觸或進入機體后對機體產(chǎn)生的損傷，有急性毒性和慢性毒性2種。在應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌對毒物進行生物毒性評價時，發(fā)光細(xì)菌因在毒物中暴露時間較短，通常被認(rèn)為是一種急性毒性評估。急性毒性的測試是毒理學(xué)安全性評價的基礎(chǔ)性試驗，是制訂衛(wèi)生管理標(biāo)準(zhǔn)不可或缺的依據(jù)[23]。隨著急性毒性評價方法的不斷發(fā)展，當(dāng)前中國的急性毒性試驗主要采用傳統(tǒng)方法(GB 15193. 3—2003)[24]。但由于使用動物數(shù)量較大且LD50的測試受動物及實驗室環(huán)境的影響，在“3Rs”原則，即減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)、替代(replacement)[25]下，衍生出了固定劑量法(fixed dose procedure，F(xiàn)DP)、急性毒性分類法(acute toxic class method，ATC)、上下法(up-and-down procedure，UDP)等方法，旨在采取其他措施來減少試驗中動物的痛苦，這3種方法是目前常用的方法。其與利用發(fā)光細(xì)菌檢測相比優(yōu)缺點見表1[10,21,26-27]。

表1 急性毒性評估中傳統(tǒng)方法和發(fā)光細(xì)菌檢測方法的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of traditional methods and luminescent bacteria detection methods in acute toxicity assessment

2.2 發(fā)光細(xì)菌在毒性評估中的應(yīng)用

細(xì)菌發(fā)光在毒理學(xué)中的應(yīng)用從發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用于生態(tài)監(jiān)測開始，目前仍被廣泛地應(yīng)用，關(guān)于發(fā)光菌在毒性評估中的研究與應(yīng)用主要集中在環(huán)境科學(xué)的各個領(lǐng)域[28-29]。在食品行業(yè)，可見報道主要集中在發(fā)光細(xì)菌用于食品添加劑、農(nóng)藥和獸藥的毒性評價。Cai等[30]研究了5種典型的農(nóng)藥(樂果、馬拉硫磷、阿特拉津、滅草靈、乙草胺)對發(fā)光細(xì)菌的毒性作用及其作用機制。石穎等[31]分別用8種獸藥作用于青?；【鶴67，發(fā)現(xiàn)Q67的相對發(fā)光率與獸藥濃度呈反比，并總結(jié)了8種獸藥的抑制效率。

這些研究多集中在對單一物質(zhì)的毒性評價，但在實際的檢測應(yīng)用中，食品成分具有復(fù)雜性，化學(xué)混合物的毒性具有聯(lián)合作用，如拮抗作用、協(xié)同作用或加和效應(yīng)等，發(fā)光細(xì)菌會受多種有毒物質(zhì)的影響。因此，研究混合毒物對發(fā)光細(xì)菌的毒性作用具有重要的意義?；诖?，吳淑杭[32]以青海弧菌、費氏弧菌和明亮發(fā)光桿菌T3為受試對象，研究重金屬、農(nóng)藥和獸藥等農(nóng)產(chǎn)品污染物的單一毒性和聯(lián)合毒性，揭示多種污染物共存時產(chǎn)生的毒性聯(lián)合作用與綜合生物毒性，并建立專用數(shù)學(xué)模型。

在聯(lián)合毒性的研究中，選擇合適的聯(lián)合毒性評價模型進行毒性評價非常重要，常用的聯(lián)合毒性評價方法有指數(shù)法、濃度加和與獨立作用模型(CA/IA)法以及定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系模型(QSAR模型)預(yù)測法[33-34]。3種毒性評價方法各有優(yōu)劣，在應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)實際情況進行選擇。目前關(guān)于這些模型在發(fā)光細(xì)菌中的應(yīng)用也有諸多報道，張瑾等[35]以青?；【鶴67為受試微生物，測定6種吡啶類離子溶液組成的4組二元混合物和2組三元混合物的聯(lián)合毒性，用濃度加和模型進行分析，結(jié)果表明：除了有一組主要是拮抗作用外，其他組都是加和作用。董玉瑛等[36]測定了3種醫(yī)藥成分：阿奇霉素、鹽酸環(huán)丙沙星和阿司匹林組成的混合體系對發(fā)光細(xì)菌的聯(lián)合毒性，應(yīng)用多種方法進行評價，得出的結(jié)果具有一致性，說明這些評價方法在聯(lián)合毒性中具有可行性。

3 發(fā)光細(xì)菌在食品安全檢測中的應(yīng)用

3.1 發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用現(xiàn)狀

表2顯示了國內(nèi)外學(xué)者利用發(fā)光細(xì)菌在部分食品安全檢測中的應(yīng)用。由表2可知，目前國內(nèi)外的研究重點主要集中在以天然發(fā)光細(xì)菌為代表的非特異性發(fā)光細(xì)菌的應(yīng)用上。在食品原料選擇上，以農(nóng)畜產(chǎn)品居多，比如蔬菜、肉類、奶類，很少涉及其他食品種類。而且在農(nóng)畜產(chǎn)品中以畜產(chǎn)品為原料的研究最多，在檢測毒物種類上，主要集中在對農(nóng)獸藥，尤其是對獸藥進行檢測，而對食品添加劑、食品中的生物毒素以及其他有毒有害物質(zhì)的檢測較少，并且在獸藥檢測中，很少涉及一些激素類獸藥如糖皮質(zhì)激素等的檢測研究。

在發(fā)光細(xì)菌的選擇方面，以青?；【鸀榇淼牡l(fā)光細(xì)菌逐漸成為研究的熱門。因為與海洋發(fā)光細(xì)菌相比，青海弧菌在檢測時不需要保證2%～3%的氯化鈉濃度，避免了NaCl對樣品特性的干擾。

在特異性發(fā)光細(xì)菌研究應(yīng)用方面，目前在食品科學(xué)領(lǐng)域的研究報道較少，大多集中在四環(huán)素類抗生素以及少量關(guān)于β-內(nèi)酰胺類藥物的研究上。盡管特異性工程細(xì)菌在食品科學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用剛剛起步，但其在環(huán)境科學(xué)中已有深入研究，已經(jīng)建立了對多種重金屬能夠特異性檢測的工程菌[46]。這些研究可以為發(fā)光細(xì)菌在食品安全檢測中的應(yīng)用提供借鑒。

3.2 檢測效果的影響因素

發(fā)光細(xì)菌是一種生物檢測技術(shù)，發(fā)光細(xì)菌本身具有不確定性，且樣品的組成具有復(fù)雜性。因此在實際檢測過程中，檢測效果會受到多種因素的影響，如原料前處理、毒物興奮效應(yīng)、樣品刺激作用等。

3.2.1 原料前處理 在食品安全檢測中，樣品前處理占據(jù)整個樣品分析的大部分時間，并且檢測結(jié)果的重復(fù)性、準(zhǔn)確性以及方法的靈敏度都與樣品前處理過程密切相關(guān)。理想的原料預(yù)處理方法，不僅能獲得待檢測物質(zhì)，還能夠減少對發(fā)光細(xì)菌檢測的干擾。目前，在樣品前處理中常用的方法有溶劑萃取法和離心法。在國內(nèi)外的一些研究中，都是將原料絞碎、離心，然后取上清液備用[41,47-48]，但這些方法均存在提取不徹底的缺點，這使發(fā)光細(xì)菌檢測技術(shù)不能準(zhǔn)確地反映被檢樣品的毒性。并且在用有機溶劑萃取時，有機溶劑也可能會對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強度造成影響。因此，Pellinen等[40]在檢測魚肉中四環(huán)素時，對處理魚肉樣品的方法進行了優(yōu)化，在均質(zhì)之后不進行離心，也不使用有機溶劑，優(yōu)化后的方案可使四環(huán)素的檢出限更低。

表2 國內(nèi)外學(xué)者在食品安全檢測中應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌的部分研究Table 2 The application of luminescent bacteria in food safety detection

在利用發(fā)光細(xì)菌進行快速檢測時，無色或顏色較淺的液體樣品比較容易測試，而固體樣品則必須經(jīng)過前期處理才能進行檢測。在固體樣品的預(yù)處理方面，一些適用于其他生物檢測的預(yù)處理方法如固相萃取[49]等，也適用于發(fā)光細(xì)菌檢測。

3.2.2 毒物興奮效應(yīng) 毒物興奮效應(yīng)(Hormesis)是一種生物體的適應(yīng)性反應(yīng)，它是指在致毒因素不同的劑量強度范圍，生物體具有不同的劑量—反應(yīng)關(guān)系[50]。Hormesis通常被認(rèn)為是毒物對生物體在高劑量時表現(xiàn)負(fù)面影響(如生長發(fā)育受到抑制)，但在低劑量時卻表現(xiàn)為有益作用(如刺激生長發(fā)育)[51]，其主要應(yīng)用于遺傳毒性致癌物健康風(fēng)險評估與毒物生態(tài)風(fēng)險評估上。大多數(shù)農(nóng)、獸藥都顯示出毒物興奮效應(yīng)，Calabrese等[51]指出青霉素、鏈霉素、土霉素、氯霉素、硫藤黃菌素、抗金葡美蘇、磺胺、桿菌肽、吡啶硫胺素等藥物在低劑量下能夠刺激生物體生長；Morse[52]認(rèn)為需要考慮農(nóng)藥的Hormesis，從而完整了解農(nóng)藥的潛在影響。

在發(fā)光細(xì)菌毒性評估中，也會出現(xiàn)毒物興奮效應(yīng)。湯淼等[53]以費氏弧菌作為受試生物，鹽酸四環(huán)素作為研究對象，證明了在細(xì)菌生長的延滯期和平臺期，鹽酸四環(huán)素對費氏弧菌的發(fā)光強度存在時間依賴型毒物興奮效應(yīng)。Shen等[54]通過建立劑量—效應(yīng)曲線和時間—效應(yīng)曲線研究了Cu、Zn、Cd、Cr對青?；【挠绊懀l(fā)現(xiàn)4種金屬對青?；【哂忻黠@的毒物興奮效應(yīng)。

3.2.3 樣品刺激作用 在利用發(fā)光細(xì)菌進行毒性評估和食品安全檢測時，樣品中的某些非研究對象也會引起發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強度的變化。已有的研究表明，低劑量的K+、Ca2+、Na+等無機離子均對天然發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生刺激作用[53]，并且這種刺激作用在淡水重組菌中并未出現(xiàn)減弱現(xiàn)象[55]。

樣品的刺激作用具有兩面性，在海洋發(fā)光細(xì)菌利用過程中，需要2%～3%的NaCl溶液來模仿海洋環(huán)境，并用其處理樣品，溶液中的KCl、NaCl等無機物會對發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生刺激作用，在毒性測試中使發(fā)光細(xì)菌保持最大發(fā)光強度。但是這種鹽溶液有可能會改變樣品性質(zhì)，如降低金屬的生物利用率和有機物的溶解性[56]，這都會使檢測誤差偏大。

4 結(jié)論與展望

發(fā)光細(xì)菌繁殖速度快，易于培養(yǎng)和觀察，這為其在檢測中的應(yīng)用提供了一個廣闊的發(fā)展空間。發(fā)光細(xì)菌檢測方便快捷且成本低，雖然在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得長足的發(fā)展，但在食品科學(xué)領(lǐng)域，尤其是在食品安全檢測中的研究與應(yīng)用起步較晚，其前期研究主要停留在整體水平以及細(xì)胞水平，目前正向基因水平和分子水平的方向縱深發(fā)展。因此，在食品領(lǐng)域，對發(fā)光細(xì)菌展望如下：

(1) 發(fā)光細(xì)菌在食品安全檢測中的應(yīng)用研究范圍需要擴大，不應(yīng)僅僅停留在農(nóng)畜產(chǎn)品檢測方面，應(yīng)拓寬至其他深加工食品中；并且被檢測物質(zhì)應(yīng)包含農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、食品添加劑以及生物毒素等有毒有害物質(zhì)，全方位地確保食品安全。

(2) 在諸多限制發(fā)光細(xì)菌檢測發(fā)展的因素中，原料前處理方式、毒物興奮效應(yīng)以及樣品自身的刺激作用是制約該方法發(fā)展的主要因素，應(yīng)尋求合理的解決方式減少這些影響。

(3) 在特異性發(fā)光細(xì)菌研究方面，應(yīng)積極借鑒其他領(lǐng)域的成功經(jīng)驗，構(gòu)建出在食品有毒有害物質(zhì)檢測中能實現(xiàn)特異性檢測的發(fā)光細(xì)菌。

(4) 在熱門發(fā)光細(xì)菌青?；【难芯糠矫妫瑧?yīng)對發(fā)光機理及毒物興奮效應(yīng)進行系統(tǒng)研究，從而為其在食品安全檢測中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

(5) 制定關(guān)于發(fā)光細(xì)菌在食品行業(yè)使用的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)在可作為參考的只有GB/T 15441—1995，發(fā)光細(xì)菌的研究取得了很大進展，如發(fā)光細(xì)菌凍干粉、發(fā)光細(xì)菌固體培養(yǎng)試劑盒以及發(fā)光細(xì)菌毒性檢測儀的商業(yè)化。因此，急需完善相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)政策，以推動該產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展。