劉 偉 劉天琦 葛豫煒 歐陽艷

(伊犁師范學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000)

野生櫻桃李(Prunuscerasifera)俗稱野酸梅，薔薇科李屬，落枝灌木或小喬木[1]。植株多分枝，成熟葉片為橢圓形、卵圓形或倒卵形，少數(shù)出現(xiàn)橢圓狀披針形。就世界范圍而言，野生櫻桃李主要分布于中亞天山、高加索、小亞細(xì)亞及巴爾干半島[2]，櫻桃李的野生種在中國(guó)僅分布于新疆伊犁地區(qū)霍城縣的科古爾琴山的大西溝和小西溝等的10多條山溝中，集中分布于海拔1 000～1 600 m的溝谷和多石礫的陽坡地，已被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物和新疆維吾爾自治區(qū)Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。中國(guó)學(xué)者[3-4]對(duì)野生櫻桃李的研究多集中在其生態(tài)、栽培及果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分等方面，對(duì)其有效成分的提取與活性研究近年來才逐步開展。野生櫻桃李果實(shí)抗氧化活性與多酚含量有明顯相關(guān)性，矢車菊3-半乳糖苷、矢車菊3-葡萄糖苷是櫻桃李果皮中含量最多的花色苷[5-7]。課題組[8-10]前期研究發(fā)現(xiàn)野生櫻桃李葉醇提物中含有多種黃酮類化合物，具有很好的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性，為野生櫻桃李葉發(fā)揮活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但對(duì)化學(xué)成分的分離純化和鑒定尚未見報(bào)道。近年來從天然產(chǎn)物中尋找可能發(fā)展為新藥的先導(dǎo)化合物的研究備受重視，對(duì)于活性物質(zhì)的快速分析在天然產(chǎn)物研究中具有重要意義。HPLC-MS/MS技術(shù)在化學(xué)成分研究中的應(yīng)用已顯優(yōu)勢(shì)，是天然產(chǎn)物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的有力手段，但其昂貴的價(jià)格以及對(duì)使用者的技術(shù)要求阻礙了它的普及[11]。ACQUITY QDa與傳統(tǒng)質(zhì)譜相比較，直觀易用，節(jié)約時(shí)間，能在常規(guī)分析中獲得具有一致性的高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)擬建立UPLC法快速測(cè)定野生櫻桃李葉黃酮苷元含量的檢測(cè)方法，利用UPLC-UV-QDa聯(lián)用系統(tǒng)快速分析鑒定野生櫻桃李葉中化學(xué)成分，為物質(zhì)基礎(chǔ)的導(dǎo)向性分離提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

野生櫻桃李葉：分別于2017年9月采自新疆伊犁霍城縣大西溝，其中樣1紫果葉、樣2紅果葉均采樣于陽坡，樣3紫果葉、樣4紅果葉均采樣于溝谷，經(jīng)伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所趙玉教授鑒定為薔薇科野生櫻桃李葉，洗凈，陰干后60 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩備用，樹葉標(biāo)本存放于伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所；

山奈酚、槲皮素、異鼠李素：HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖：HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

乙醇、鹽酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、甲酸：色譜純，阿達(dá)瑪斯試劑(上海)有限公司；

石油醚(60～90 ℃)：分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLC H-Class，配備光電二極管矩陣(PDA)檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；

質(zhì)譜儀：ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，美國(guó)Waters公司；

電子天平：Sartorius BSA124S型，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制 分別精密稱取2.5 mg槲皮素、5.0 mg山奈酚、2.5 mg異鼠李素置于25 mL容量瓶中，無水甲醇超聲溶解，冷卻后定容，得到質(zhì)量濃度分別為100，200，100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，配制20，40，60，80，100，120，200 μg/mL(以山奈酚計(jì))的混合標(biāo)準(zhǔn)液，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品溶液的制備 稱取0.25 g野生櫻桃李(樣1)葉2份，加入石油醚(60～90 ℃)25 mL，水浴加熱至沸騰，并保持微沸1 h，脫脂，去葉綠素，抽濾后將濾渣晾干。其中1份加入無水甲醇25 mL，另1份加入無水甲醇20 mL和4 mol/L 的鹽酸5 mL，分別于80 ℃回流3.0 h，抽濾，離心后將濾液用無水甲醇定容至25 mL容量瓶中，得到野生櫻桃李葉醇提物和水解液，取1.0 mL過0.22 μm微孔濾膜，取濾液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。標(biāo)準(zhǔn)品和水解樣品分析色譜條件Ⅰ：梯度洗脫方法為0～7 min，35%～52% B；7～8 min，52%～100% B；8～9 min，100%～35% B。流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積1.0 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。醇提物分析色譜條件Ⅱ：梯度洗脫方法為0～10 min，5%～22% B；10～11 min，22%～28% B；11～32 min，28%～43% B，流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積1.0 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.2.4 質(zhì)譜條件 ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器，Performan-ce模式；ESI負(fù)離子全掃描，100～800 Da；錐孔電壓15 V，毛細(xì)管電壓0.8 kV；離子源溫度600 ℃；Empower操作系統(tǒng)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品測(cè)定 按照1.2.3色譜條件進(jìn)樣1.0 μL，以峰面積(Y)與相應(yīng)的濃度(X)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃酮苷元的含量。

1.2.6 方法學(xué)考察 參考文獻(xiàn)[12～13]，以預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件Ⅰ進(jìn)行方法學(xué)考察。取同一份混合標(biāo)準(zhǔn)品(山奈酚濃度為100 μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣1.5 μL，計(jì)算相應(yīng)保留時(shí)間和峰面積的RSD，考察試驗(yàn)精密度；取樣1水解液每隔2 h進(jìn)樣1.5 μL，進(jìn)樣6次，計(jì)算相應(yīng)峰面積的RSD，考察試驗(yàn)穩(wěn)定性；平行稱取0.25 g樣1共5份，按照1.2.2方法制備水解液，分別進(jìn)樣1.5 μL，計(jì)算槲皮素和山奈酚含量和相應(yīng)峰面積的RSD，考察試驗(yàn)重復(fù)性；平行稱取0.25 g樣1共6份，分別向樣品中添加低、中、高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品(相當(dāng)于樣品中含量的80%，100%，120%)，按照1.2.2方法制備水解液6份，分別進(jìn)樣1.5 μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算槲皮素和山奈酚的含量、回收率和RSD，考察試驗(yàn)加標(biāo)回收率。

1.2.7 樣品含量測(cè)定 采用外標(biāo)法測(cè)定4種不同樣品中黃酮苷元的含量，參考Sticher等[14]提出的通過轉(zhuǎn)換因子(槲皮素、山奈酚轉(zhuǎn)換因子分貝為2.51和2.64)由黃酮苷元計(jì)算總黃酮含量的方法，根據(jù)公式計(jì)算4種不同樣品總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解試驗(yàn)

由圖1可知，野生櫻桃李葉水解液色譜圖中峰1、峰2分別與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素、山奈酚保留時(shí)間一致，且表現(xiàn)出相同的特征紫外吸收，可確定峰1、峰2為槲皮素和山奈酚，水解樣品中未檢測(cè)到異鼠李素。取水解液以乙酸乙酯—異丙醇—水為展開劑，通過苯胺—二苯胺-磷酸法顯色，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物中存在鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖(極性由小到大)。說明野生櫻桃李葉中主要含有以槲皮素和山奈酚為苷元的黃酮類化合物。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品和野生櫻桃李葉水解液UPLC色譜圖Figure 1 UPLC chromatograms of reference substances and hydrolysates

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.2.3色譜條件Ⅰ將不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液各進(jìn)樣1.5 μL，以峰面積(Y)與相應(yīng)的濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性分析，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度 結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚、異鼠李素保留時(shí)間分別為4.1，5.9，6.4 min，保留時(shí)間RSD值分別為0.86%，0.67%，0.59%；峰面積的RSD值分別為1.08%，0.74%，0.75%，表明儀器的精密度較好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系和精密度考察Table 1 Linear relationship and precision of three standard samples (n=7)

2.3.2 穩(wěn)定性 結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.98%，0.49%，表明水解液室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原料中槲皮素和山奈酚平均含量分別為3.651 4，7.679 6 mg/g，峰面積的RSD分別為1.29%，1.07%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加標(biāo)回收率 由表2可知，槲皮素和山奈酚的平均回收率分別為98.65%，102.02%，RSD均小于2%，說明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品的測(cè)定

由表3可知，不同樣品所含黃酮苷元中山奈酚含量均明顯高于槲皮素，說明野生櫻桃李葉中黃酮類成分以山奈酚苷類化合物居多。陽坡樣品總黃酮含量均高于溝谷樣品，諸姮等[15]研究發(fā)現(xiàn)光照能夠強(qiáng)烈地影響植物的初生代謝、植物細(xì)胞生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物積累。分析原因是陽坡日照時(shí)間長(zhǎng)、輻射強(qiáng)度大、土壤干燥等因素促使野生櫻桃李葉產(chǎn)生抗逆性，局部器官或組織合成較多的黃酮類化合物，以利于自身的保護(hù)。文獻(xiàn)[16]報(bào)道不同遺傳背景的植物存在成分和含量差異，與本試驗(yàn)中不同生長(zhǎng)環(huán)境下紫果葉中黃酮苷元總含量均高于紅果葉相吻合。

表2 野生櫻桃李葉中添加標(biāo)準(zhǔn)品的回收率Table 2 Recoveries of standards in extraction of leaves (n=3)

表3 不同供試品中黃酮含量測(cè)定Table 3 Determination of the flavonoids content in different samples (n=3) mg/g

2.5 醇提物化學(xué)成分

由圖2可知，醇提物中化合物1極性較大且含量較高；化合物2～9保留時(shí)間集中在13～18 min，說明化合物極性相近；化合物10～12含量較低，各峰之間分離度可滿足質(zhì)譜分析。

ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器直觀易用，擺脫了傳統(tǒng)質(zhì)譜儀的操作復(fù)雜性，可快速獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)化合物進(jìn)行快速鑒定，補(bǔ)充了諸如PDA等光學(xué)檢測(cè)器的不足。本試驗(yàn)基于野生櫻桃李葉醇提物化學(xué)成分的紫外和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合水解試驗(yàn)，根據(jù)課題組前期研究積累經(jīng)驗(yàn)并參考文獻(xiàn)[17～25]，對(duì)野生櫻桃李葉醇提物黃酮成分進(jìn)行快速分析，結(jié)果見表4。其中1號(hào)峰UVmax為219, 230, 326 nm，分子離子峰m/z為353.20 [M-H]-，推測(cè)為單咖啡?？鼘幩醄22,26]。10、11、12號(hào)峰含量較低，質(zhì)譜數(shù)據(jù)復(fù)雜，未做推斷。

圖2 野生櫻桃李葉醇提物UPLC譜圖Figure 2 UPLC chromatograms of methanol extract from Prunus cerasifera Leave表4 野生櫻桃李葉醇提物黃酮苷紫外質(zhì)譜分析結(jié)果Table 4 UV and MS analysis results of flavone glycosides of methanol extract

峰號(hào)保留時(shí)間/minUVmax /nm[M-H]-(m/z) 黃酮苷元推測(cè)單糖類型單糖個(gè)數(shù)文獻(xiàn)213.927255, 356463.25槲皮素半乳糖、葡萄糖單糖[17～18]314.348255, 356463.21槲皮素半乳糖、葡萄糖單糖[17～18]414.759264, 349431.26山柰酚鼠李糖單糖[19～20]515.027266, 346563.22山奈酚鼠李糖和阿拉伯糖或木糖雙糖[19, 21]616.054255, 351433.19槲皮素木糖苷、阿拉伯糖單糖[22～23]716.652264, 348609.22山奈酚半乳糖、葡萄糖雙糖[17～18]817.017264, 346563.19山奈酚鼠李糖和阿拉伯糖或木糖雙糖[19～20]917.126264, 344577.23山奈酚鼠李糖雙糖[24～25]1019.175264, 335-山奈酚--1120.106264, 337-山奈酚--1221.495255, 349-槲皮素--

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，以槲皮素和山奈酚為苷元，與鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等縮合而成的黃酮苷為野生櫻桃李葉中主要成分。UPLC測(cè)定水解產(chǎn)物中槲皮素和山奈酚的含量在7 min內(nèi)完成，精密度RSD值分別為1.08%，0.74%，重復(fù)性RSD值分別為1.29%，1.07%，穩(wěn)定性RSD值分別為0.98%，0.49%，平均回收率分別為98.65%，102.02%，RSD均小于2%，說明該方法快速、準(zhǔn)確、可行。4種不同樣品的總黃酮含量為(19.15±2.94)～(29.69±3.56) mg/g，其中陽坡紫果葉>溝谷紫果葉>陽坡紅果葉>溝谷紅果葉。通過UPLC-UV-QDa聯(lián)用系統(tǒng)快速分析陽坡紫果葉醇提物主成分為1種單咖啡?？鼘幩帷?種槲皮素糖苷、7種山奈酚糖苷。UPLC-UV-QDa聯(lián)用系統(tǒng)使分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行，能夠快速、準(zhǔn)確、有效地鑒別物質(zhì)。對(duì)野生櫻桃李葉醇提物化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的確定，課題組將通過柱色譜和制備色譜等手段分離、純化后進(jìn)一步研究。